分子生物學(xué)與慢性粒細(xì)胞白血病課件

1、分子生物學(xué)在慢粒（AML）的發(fā)病機(jī)理、基因診斷及治療中的應(yīng)用分子生物學(xué)在慢粒（AML）的發(fā)病機(jī)理、基因診斷及治療中的應(yīng)用一、概述慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)簡稱慢粒。概念：是一種發(fā)生在早期多能造血干細(xì)胞上的惡性骨髓增殖性疾病（獲得性造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病)。Chronic myelogenous leukemia, chronic phase. 一、概述慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid l病因：CML的病因比較復(fù)雜，較為公認(rèn)的致病因素是電離輻射，如X射線、射線等。暴露于輻射的人群有較高的CML發(fā)病率。日本廣島及長崎原子彈輻射后

2、，慢粒的發(fā)病率較未照射人群高17倍。主要特點(diǎn)：本病病程發(fā)展緩慢，外周血粒細(xì)胞顯著增多且不成熟，脾臟明顯腫大。自然病程可經(jīng)歷慢性期、加速期和急變期，多因急性變而死亡。本病各年齡組均可發(fā)病，以中年最多見。 病因：CML的病因比較復(fù)雜，較為公認(rèn)的致病因素是電離輻射，如二、CML分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)理Ph染色體與融合基因 90%以上的慢?；颊咧锌砂l(fā)現(xiàn)有Ph染色體，即t(9；22)(q34；q11)，9號染色體q34上的原癌基因c-ABL的片段易位至22號染色體q11上的斷裂點(diǎn)簇集區(qū)（breakpoint cluster region，BCR），產(chǎn)生BCR-ABL融合基因。這也是人類在白血病染色體易位中發(fā)現(xiàn)

3、的第一個(gè)融合基因。二、CML分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)理Ph染色體與融合基因Cytogenetic Abnormality of CML:The Ph Chromosome922Cytogenetic Abnormality of CML分子生物學(xué)與慢性粒細(xì)胞白血病課件 Bcr/abl融合基因的結(jié)構(gòu) Bcr/abl融合基因的結(jié)構(gòu)Bcr/abl融合蛋白與白血病1.p210BCR-ABL, 見于絕大部分CML及50%以上成人Ph染色體陽性的ALL。2.p190BCR-ABL, 常見于50%Ph染色體陽性的成人ALL和80%Ph染色體陽性的兒童ALL。3.p230BCR-ABL, which is assoc

4、iated with rare cases of Ph-positive CML.Bcr/abl融合蛋白與白血病1.p210BCR-ABL, Bcr-abl融合基因致病的分子機(jī)制Bcr/abl融合基因的編碼產(chǎn)物p210、p230等融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸蛋白激酶活性，可激活結(jié)構(gòu)性酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）。而酪氨酸激酶是一種催化ATP-磷酸酶轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而激活細(xì)胞中多種信號轉(zhuǎn)到途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生。Bcr-abl融合基因致病的分子機(jī)制Bcr/abl融合基因的三、BCR

5、-ABL融合基因的分子生物學(xué)檢測技術(shù)1.RT-PCR ：是以 mRNA 為模板反轉(zhuǎn)錄出cDNA，再以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，是在 RNA 水平上檢測 BCR-ABL 融合基因。該方法靈敏度高，可用于 MRD 的檢測，但反轉(zhuǎn)錄-PCR 是一種定性實(shí)驗(yàn)，不能對白血病患者的 BCR-ABL 融合基因給出定量分析，也可能會(huì)因 RNA 降解而出現(xiàn)假陰性。三、BCR-ABL融合基因的分子生物學(xué)檢測技術(shù)1.RT-PC2.實(shí)時(shí)定量熒光-PCR：是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)，在 PCR 擴(kuò)增的同時(shí)，加入引物的同時(shí)加入特異性的熒光探針; 是通過實(shí)驗(yàn)檢測過程中的熒光強(qiáng)度變化對 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的一種定

6、量檢測方法。實(shí)時(shí)定量熒光PCR 由于其具靈敏度高( 10 5 10 6) 、可準(zhǔn)確定量觀察、迅速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在MRD 檢測中具有非常重要的優(yōu)勢。2.實(shí)時(shí)定量熒光-PCR：是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)，在3.CBA 法：是指用已知大小及性質(zhì)的磁珠與一組可溶的蛋白分析物結(jié)合，以檢測人類血液樣本的 BCR-ABL 融合蛋白。其檢測試劑為一種結(jié)合藻紅蛋白( phycoerythrin，PE) 的單克隆抗體，可對 BCR-ABL 蛋白的 ABL 特異性結(jié)合，當(dāng)免疫磁珠與 BCR-ABL 融合蛋白共混時(shí)，則可形成三明治狀的復(fù)合物，蛋白的 BCR 端為結(jié)合了抗體的微球，ABL 端為結(jié)合了藻紅蛋白的抗

7、體?；诳贵w的大小及性質(zhì)，可使用流式細(xì)胞儀對該種復(fù)合物進(jìn)行研究，從而檢測出 BCR-ABL 融合蛋白。3.CBA 法：是指用已知大小及性質(zhì)的磁珠與一組可溶的蛋白分BCR-ABL 融合基因可翻譯產(chǎn)生融合蛋白可以被抗 BCR 的捕獲磁珠及連接 PE 的抗 ABL 抗體結(jié)合。在流式細(xì)胞儀上對捕獲磁珠的檢測，可檢測出 PE 的熒光信號。BCR-ABL 融合基因可翻譯產(chǎn)生融合蛋白可以被抗 BCR 4.FISH 法：是利用標(biāo)記的 DNA 或 RNA 探針直接在染色體、細(xì)胞或組織水平定位特定靶核酸序列的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量。主要應(yīng)用于染色體易位形成的融合基因檢測、

8、基因缺失的檢測及MRD檢測等。具有快速、安全、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。對白血病臨床療效的判定及預(yù)測預(yù)后也具有重要意義。4.FISH 法：是利用標(biāo)記的 DNA 或 RNA 探針直接5.Southern印跡(Southern Blot) 法 可對bcr-abl融合基因DNA重排進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。將待測基因組DNA片段經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相雜交膜上，用取自M-bcr3和5端的bcr探針與之雜交，經(jīng)放射自顯影洗片后即可顯示所要檢測的條帶，對于CML患者，除可見到一條與胚系bcr基因組DNA相對應(yīng)的條帶外，其他的條帶說明存在重排的bcr等位基因。5.Southern印跡(Southern Bl

9、ot) 法Southen 印記法實(shí)驗(yàn)流程圖Southen 印記法實(shí)驗(yàn)流程圖 四、分子靶向治療（molecular targeting treatment）信號傳導(dǎo)抑制劑 ( Signal Transduction Inhibitor , STI) 四、分子靶向治療（molecular targetin分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate），商品名為格列衛(wèi)，為治療CML的常用分子靶向藥物。屬小分子化合物，是一種特異性很強(qiáng)的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）。對體內(nèi)眾多酪氨酸激酶，它僅能抑制BCR-ABL融合基因產(chǎn)物P210和P190、PDGFR（血小板衍化生長因

10、子）與c-Kit受體的酪氨酸激酶。分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（imatin格列衛(wèi)藥理作用的分子機(jī)制格列衛(wèi)通過特異性地與BCR/ABL激酶結(jié)構(gòu)域的ATP位點(diǎn)結(jié)合，抑制其酪氨酸激酶活性,使酪氨酸殘基不能磷酸化，從而抑制其細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑,促使細(xì)胞凋亡和抑制Ph陽性白血病細(xì)胞的增殖。格列衛(wèi)是CML治療史上的里程牌,并且對CML具有很好的療效，可使患者達(dá)到遺傳學(xué)或分子生物學(xué)緩解。格列衛(wèi)藥理作用的分子機(jī)制格列衛(wèi)通過特異性地與BCR/ABL激 Mechanism of action of imatinib. By occupying the ATP binding pocket of the ABL kinase domain, imatinib prevents substrate phosphorylation and downstream activation of sig