第五章分子生物學(xué)研究法基因工程

1、第五章 分子生物學(xué)研究法 八. 基因工程 基因工程的主要內(nèi)容:從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。 載體的選擇, 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選 擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞。在寄主細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白。第五章 分子生物學(xué)研究法 八. 基因工程 基因工程的基本操作程序的四個(gè)過程: 目的基因的獲取 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 目的基因的檢測與鑒定第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的獲取 生物材料mRN

2、A限制性內(nèi)切酶一定大小范圍DNA片段cDNA反轉(zhuǎn)錄酶 基因組文庫 cDNA文庫 基因文庫 p. 183人工合成獲得目的基因DNAPCR1. 目的基因的獲取第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的獲取 目的基因的獲取:(RT)- PCR擴(kuò)增基因文庫化學(xué)合成法 DNA片段 cDNA片段基因組文庫cDNA基因文庫第五章 分子生物學(xué)研究法 載體構(gòu)建 2. 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1) 基因表達(dá)載體的選擇 2) 目的基因與載體的連接 第五章 分子生物學(xué)研究法 載體的構(gòu)建 圖: EcoR I 和Pvu II 雙酶切質(zhì)粒載體 和目的基因及目 的基因與載體的 連接。* 這種連接方式稱為 取向退火形成重組 DNA分子。

3、Pvu II載體末端載體末端目的基因插入的目的基因Pvu II第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 3.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 1) 原核生物的人工轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化） 感受態(tài) (competence) 細(xì)菌容易吸收外源DNA時(shí)的生理狀態(tài)。 在自然界中不是所有細(xì)菌都能夠吸收DNA 也不是任何生長階段都具有吸收DNA的能力 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 研究發(fā)現(xiàn)： 細(xì)菌的感受態(tài)是可以誘導(dǎo)的，而且此時(shí)細(xì)菌攝取DNA 是非選擇性。 可通過電擊法或CaCl2、RbCl/KCl等化學(xué)試劑處理細(xì) 胞, 使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時(shí)性的改變,容易接受外界 DNA, 這類細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞

4、 (competent cells)。 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 原核生物的人工轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化） 是指細(xì)菌的感受態(tài)細(xì)胞接收外源DNA而獲得了新的遺傳 性狀的過程。 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 （1）轉(zhuǎn)化方法 CaCl2轉(zhuǎn)化法 用CaCl2處理受體大腸桿菌細(xì)胞得到感受態(tài)細(xì)胞。 操作方法: 感受態(tài)細(xì)胞 +帶有目的基因的質(zhì)粒載體在 42C, 處理1-2 min；然后冰浴中 2 min。 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 優(yōu)點(diǎn): 簡單、穩(wěn)定、可重復(fù)性高。 缺點(diǎn): 轉(zhuǎn)化效率稍低，每微克DNA產(chǎn)生106-107轉(zhuǎn)化子, 不能轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒載體(15Kb)

5、。 轉(zhuǎn)化率: 吸收了外源DNA的細(xì)胞在群體中所占的百分率。 在日常實(shí)驗(yàn)中，是用每微克質(zhì)粒DNA所產(chǎn)生的 重組子菌落數(shù)來表示。第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 電擊法 (electroporation) 用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或擊成小孔，使其處于感 受態(tài), DNA分子可通過細(xì)胞膜上的小孔進(jìn)入細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn): 操作方便、轉(zhuǎn)化效率高, 每微克DNA可得到 109-1010 重組子 缺點(diǎn): 需要特殊設(shè)備 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 2) 真核生物的人工轉(zhuǎn)化 （1）植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化 Ti轉(zhuǎn)化法 利用Ti或Ri載體 直接轉(zhuǎn)移法 - 電穿孔 - 微彈轟擊法（基因槍法） - 激光

6、微束穿孔法 - 多聚物介導(dǎo)法 - 花粉管通道法 - 微注射法 - 脂質(zhì)體介導(dǎo)法第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 （2） 動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化 病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法 DMSO（二甲基亞砜）轉(zhuǎn)染法 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 顯微注射 基因打靶 電穿孔 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 4. 目的基因的檢測與鑒定 1) 原核生物轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)與篩選 利用抗菌素抗性 基因或X-gal和 IPTG藍(lán)白斑進(jìn)行 選擇。 轉(zhuǎn)化子: 帶有外源DNA的受 體細(xì)胞。第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 2) 原核生物重組子的鑒定 質(zhì)粒DNA分離和純化 雙酶切片段重組法

7、 主要檢查DNA片段的定向等。 DNA序列分析重組子: 帶有重組DNA的受 體細(xì)胞。第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 實(shí)驗(yàn)室一般使用下列兩種方法制備質(zhì)粒DNA： 氯化銫-EtBr密度梯度離心法 堿裂解法 質(zhì)粒DNA分離純化第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 氯化銫-EtBr密度梯度離心法 氯化銫的作用：離心的介質(zhì)， 密度為 1.78g/cm2 離心平衡后，形成離心梯度1-1.9052g/cm3 EtBr的作用： 可插入DNA分子。第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 在細(xì)胞裂解和DNA分離過程中： - 細(xì)菌的染色體DNA分子質(zhì)量比較大, 很容易斷裂成線性片

8、段，插入的EtBr多，密度降低； - 質(zhì)粒DNA分子質(zhì)量小, 結(jié)構(gòu)緊密, 在分離過程中不易斷裂，吸 附的EtBr少，密度大。 利用這種差異來分離和純化質(zhì)粒DNA。 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 石蠟油 蛋白質(zhì) 松馳形或線形DNA (染色體DNA) 封閉環(huán)形的質(zhì)粒DNA RNA 圖: 氯化銫-EtBr密度梯度 離心法分離質(zhì)粒DNA 的基本原理和操作程 序大腸桿菌裂解液形成DNA-EtBr復(fù)合物形成密度差異離心染色體DNA片段質(zhì)粒DNA在紫外燈下吸取cccDNA（covalently closed circular DNA） 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 堿變性

9、法 (堿裂解法) 是目前質(zhì)粒DNA分離純化中常用的一種方法。 原理: 基于染色體DNA和質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性差異 而達(dá)到分離的目的。 第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 - 堿性使DNA變性 - 變性后再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒 DNA - 染色體DNA不會(huì)復(fù)性，常常聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),與變性 的蛋白質(zhì)及RNA一道被離心沉淀下去 - 用酒精沉淀法收集上清液中的質(zhì)粒DNA。第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 雙酶切片段重組法 主要檢查DNA片段的大小和方向等。 DNA序列分析第五章 分子生物學(xué)研究 目的基因的檢測與鑒定 2) 真核生物重組子的培養(yǎng)與篩選(添加抗菌素)圖: 葉圓盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化植株第五章 分子生物學(xué)研究法 目的基因的檢測與鑒定 真核生物重組子的鑒定 DNA分子檢測：Southern雜交、 PCR擴(kuò)增 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測: Northern雜交、反轉(zhuǎn)錄-PCR 翻譯產(chǎn)物檢測: 檢測酶活性、Western雜交 如果表達(dá)載體中插入報(bào)告基因, 可根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)特 性進(jìn)行檢測。 常用的報(bào)告基因有 Lac、Gus等基因 作業(yè)二名