代謝組學(xué)小常識(shí)

1、代謝組學(xué)小常識(shí)概念：代謝組：指一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物的集合，包含一系列不同類型的小分子（通常分子量1000）,比如肽、碳水化合物、脂類、核酸等。代謝組學(xué)：通過(guò)考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來(lái)研究生物體系的一門科學(xué)。實(shí)驗(yàn)流程：（以液質(zhì)聯(lián)用為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)為例）樣本前處理：在保證小分子代謝物完整的前提下，處理的步驟越簡(jiǎn)單越好，以保證 操作容易重復(fù)，也為大批量樣本的處理節(jié)約時(shí)間。數(shù)據(jù)采集：依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠兴煌?。非目?biāo)代謝組學(xué)：選用高分辨質(zhì)譜儀（TOF，Orbitrap等），有助于檢測(cè)到盡可能多 的化合物，另外高分辨的質(zhì)核比數(shù)據(jù)也有助于數(shù)

2、據(jù)庫(kù)檢索以及化合物的鑒定。目標(biāo)代謝組學(xué)：通常使用三重四極其桿質(zhì)譜，提高檢測(cè)的靈敏度以及定量的準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)預(yù)處理：峰提取，排列，歸一化。多數(shù)質(zhì)譜商家都提供了配套的預(yù)處理軟件，例如安捷倫公司的MassHunter，熱電的Sieve沃特世的 MarkerLynx 以及 Progenisis QI。Sieve同時(shí)也有一些基于網(wǎng)絡(luò)的可以免費(fèi)獲取的軟件。建議使用配套的軟件，因?yàn)椴恍枰?額外的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，不需要上傳數(shù)據(jù)，節(jié)省時(shí)間。數(shù)據(jù)分析：多元統(tǒng)計(jì)分析包括主成份分析（PCA），偏最小二乘判別分析（PLS-DA）， 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），聚類分析（HCA）等。各個(gè)廠商也提供了相應(yīng)的 統(tǒng)計(jì)分析

3、軟件，比如安捷倫的MPP，熱電的Sieve，沃特世的2山3。目前常用的第三方軟 件是Simca-p，同時(shí)也有一些網(wǎng)絡(luò)的開(kāi)源軟件可以使用。化合物鑒定：數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，二級(jí)質(zhì)譜對(duì)比。編輯版word代謝組學(xué)文章中常見(jiàn)的統(tǒng)計(jì)圖（一）主成分分析（PCA）PCA得分圖（score3人用來(lái)看樣本天然的分組情況，在分析時(shí)不加任何分組信息。圖中 每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，樣本在空間中所處的位置由其中所含有的代謝物的差異決定。編輯版word(甥-叱(甥-叱9) EQaEOQPCA載荷圖（loading優(yōu)0。，用來(lái)尋找差異變量。同種的每一個(gè)點(diǎn)代表樣本中還有的一個(gè)代 謝物物，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的代謝物被認(rèn)為對(duì)樣本的分類

4、貢獻(xiàn)越大。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）得分圖和載荷圖的解釋同PCA。區(qū)別在于，PLS-DA在分析時(shí)提前賦予每個(gè)樣本分組信息， 簡(jiǎn)單說(shuō)，就是在分析時(shí)擴(kuò)大組間差異，減少組內(nèi)差異，多用來(lái)尋找標(biāo)記物。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）編輯版word1 JHA-liSO L72fl-3 1 JHA-liSO L72fl-3 7 iVE-在OPLS-DA分析中，尋找標(biāo)記物通常使用S-plot。如圖中所示，得分圖中，兩組樣本分 布在y軸兩側(cè)，通過(guò)S-plot可以獲得標(biāo)記物在兩組中相對(duì)含量的變化。也就是說(shuō)，處在S-plot 右上角的化合物（距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對(duì)分類貢獻(xiàn)越大）在處在得分圖y軸右側(cè)的樣本中

5、含量較 高，反之亦然。代謝組學(xué)文章中常見(jiàn)的統(tǒng)計(jì)圖（二）編輯版word晏S亨ss 彘矗里5， ss晏S亨ss 彘矗里5， ssProline Phenylalanine Leucine iso leucineVail i neMethEonine Tyrosine Threorare Galact&pyranose MannoseUrea 5-oxo proline Gkrtamic acid SerineAlpha-toGapherQl Cholesterol Hypoxanthine .感編蟋柒引圖中每一行代表一個(gè)化合物，每一列代表一個(gè)樣本。上邊對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析，左邊對(duì)化合物進(jìn)行聚類分析。

6、綠色代表該化合物在樣本中含量較低，紅色代表含量較高（也有用其他顏色表示的）。通過(guò)此圖，可以直觀地看出化合物在樣本間的變化趨勢(shì)；同時(shí)也可以找出具有相同 變化趨勢(shì)的代謝物。在對(duì)化合物進(jìn)行鑒定之后或選擇出生物標(biāo)記物之后，可將化合物名稱（或 對(duì)應(yīng)的HMDB或者KEGG編號(hào)）輸入MetaboAnalyst軟件（免費(fèi)）進(jìn)行此分析, 來(lái)觀察體內(nèi)哪些代謝途徑受到了影響。編輯版word在圖中，p值越?。?logo（p）越大），pathway impact越大，證明該條代謝通路被嚴(yán)重?cái)_動(dòng)。相關(guān)性分析(correlation analysis )此分析可用來(lái)尋找化合物之間的內(nèi)在聯(lián)系（數(shù)值上的聯(lián)系），如圖中紅色表示負(fù)

7、相關(guān)，黃色表示正相關(guān)?？捎脕?lái)篩選與某一類或者某一個(gè)自己感興趣的化合物產(chǎn)生正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)的代謝物。ROC曲線Diiscovery set叫1_HCC vs.& Health）3 Metabolites AUC=0.969-4 Metabolites AUC=0.969用來(lái)評(píng)價(jià)算選出的標(biāo)記物的診斷能力。AUC曲線下面積越大，診斷能力越好。編輯版word非目標(biāo)代謝組學(xué)（untargeted metabolomics）中常用的方法學(xué) 考察的方法QC樣本的制備:混合相同體積的所有待檢測(cè)樣本，然后按照與待測(cè)樣本相同的前處理方法來(lái)處理QC樣本，之后進(jìn)樣進(jìn)行LC-MS分析。樣本檢測(cè)時(shí)，通常在檢測(cè)最開(kāi)始運(yùn)行幾

8、次QC樣本，之后根據(jù)樣本量的大小在每檢測(cè)幾個(gè)樣本之后檢測(cè)一次QC樣本。Tqst sirnplQ-Tqst sirnplQ-（畫片來(lái)竦;Want E、Wiison I D, Gifca &t al. Global metabolic profiling procedures for urine usingUPLC-MS. Nature protocols. 2010 5（6j 1035-1018.）方法學(xué)考察：方法一：最早使用的一種方法，從QC樣本的總離子流圖中選擇具有代表性的離子峰（覆蓋不同的保 留時(shí)間，不同的強(qiáng)度），在對(duì)QC樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)之后，計(jì)算這些離子的保留時(shí)間以及峰 面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏

9、差（RSD），用以考察分析方法的穩(wěn)定性以及重復(fù)性。方法二：所有樣品檢測(cè)完之后，收集所有的QC樣本的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括（峰提取，排 列，歸一化等），經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾（80%規(guī)則）之后，計(jì)算剩下的峰的峰面積的RSD值。通常如果在一個(gè)樣本中有超過(guò)70%的化合物的RSD值小于等于30%，則證明該方法有良好 的穩(wěn)定性以及重復(fù)性，所得到的數(shù)據(jù)可靠（也有不同的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比如要求16-乂5數(shù)據(jù)小 于20%，GC-MS數(shù)據(jù)小于30%等）。編輯版word里窯里窯CLMPO一理-EQ一溪右 BEUJ3Q-lld圖中柱形圖表示化合物在不同RSD范圍內(nèi)的百分比分布，折線圖表示在不同RSD范圍的累 計(jì)百分比。方法三

10、：原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理之后，將所有樣本（包括QC樣本）進(jìn)行PCA分析，在得分圖中 觀察QC樣本的聚集程度。由于QC樣本是等量混合了所有的被檢測(cè)樣本，理論上QC樣本包含了所有樣本中的代謝 物，因此QC樣本理論上會(huì)分布在原點(diǎn)周圍。圖中QC樣本緊密聚集，證明方法穩(wěn)定，重復(fù)性良好。方法四：采用混合標(biāo)準(zhǔn)品作為QC，該QC通常包含不同物理化學(xué)性質(zhì)的體內(nèi)和體外代謝物（使所選 擇的化合物具有代表性）。檢測(cè)結(jié)束后，計(jì)算這些化合物的保留時(shí)間以及峰面積的RSD用以對(duì)分離分析方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。編輯版word代謝組學(xué)研究中需要了解的質(zhì)譜知識(shí)（一）主要介紹以液質(zhì)聯(lián)用為分析工具的代謝組學(xué)研究中的常見(jiàn)問(wèn)題：1）在分析樣本時(shí)，要

11、選用什么質(zhì)譜？2）質(zhì)譜儀中通常按照質(zhì)量分析器以及聯(lián)用方式的不同對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行分類，常見(jiàn)的包括包括：?jiǎn)?四級(jí)桿，三重四級(jí)桿，飛行時(shí)間（TOF），Q-TOF，離子阱，線性離子阱億丁、），靜電場(chǎng)軌 道阱（Orbitrap），LTQ-Orbitrap等。這么多質(zhì)譜，我們應(yīng)該如何選擇？在靶向代謝組學(xué)中，通常使用三重四級(jí)桿質(zhì)譜。因?yàn)榘邢虼x組學(xué)是針對(duì)某一些特定的 化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，而LC-QqQ/MS在MRM掃描模式下對(duì)化合物進(jìn)行定量分析（如藥代 動(dòng)力學(xué)研究）已非常普遍，所以使用此方法以達(dá)到更高的靈敏度，更準(zhǔn)確的定量。在非靶向代謝組學(xué)研究中，需要選擇高分辨質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，因?yàn)楦叻直尜|(zhì)譜可以幫助我 們檢測(cè)到

12、盡可能多的化合物，提供所檢測(cè)化合物的精確分子量，同位素分布等信息，有助于 化合物的鑒定。何為高分辨？首先了解以下分辨率，分辨率就是指質(zhì)譜儀區(qū)分兩個(gè)質(zhì)量相近的離子的能 力。這個(gè)區(qū)分能力也有不同的定義，如10%峰谷分離，50%峰谷分離等。理論知識(shí)就不多解釋了，舉個(gè)例子說(shuō)明便知。以H為例，低分辨質(zhì)譜測(cè)得的H的分子量為1，而高分辨質(zhì)譜測(cè)得的H分子量為1.007825 （當(dāng)然，能測(cè)到多精確，取決于分辨率有多高）。有什么用呢？有用！以C2H4, CO, N2為例，這三者在低分辨質(zhì)譜中測(cè)得的分子量均為28,也就是 說(shuō)低分辨的質(zhì)譜沒(méi)有辦法根據(jù)分子量將三者分離;但是高分辨質(zhì)譜測(cè)得三者的分子量分別為 28.031

13、3，27.9949，28.0061，可以將三者分開(kāi)。所以在非靶向代謝組學(xué)中，由于生物樣本中化合物的組成非常復(fù)雜，所以要用高分辨的 質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到盡可能多的檢測(cè)到化合物的目的。常用的高分辨質(zhì)質(zhì)量分析器：TOF和Or比trap，以及他們與其他質(zhì)量分析器的聯(lián)用形式如 Q-TOF，Q-Orbitrap，LTQ-Orbitrap 等。編輯版word注：可以簡(jiǎn)單的認(rèn)為，分辨率越高，區(qū)分離子的能力越強(qiáng)，即能夠區(qū)分離子在很細(xì)微的分子量上 的差異。但請(qǐng)不要將分辨率和質(zhì)量精度混淆，兩者不一樣。有一個(gè)簡(jiǎn)單的類比，低分辨質(zhì)譜對(duì)比高分辨質(zhì)譜就類似于普通天平對(duì)比十萬(wàn)分之一天平，精 密天平可以區(qū)分物質(zhì)質(zhì)量的細(xì)微

14、差異，但是天平稱出的質(zhì)量準(zhǔn)確與否，取決于天平在使用之 前是否校正。代謝組學(xué)研究中需要了解的質(zhì)譜知識(shí)（二）上一篇介紹了以下質(zhì)譜的分辨率，高分辨率質(zhì)譜有區(qū)分分子量細(xì)微差異的能力，但是測(cè)得的 分子量準(zhǔn)確與否，則要看質(zhì)譜的質(zhì)量精度了。分辨率和質(zhì)量精度不一樣，高分辨質(zhì)譜也會(huì)有 質(zhì)量偏差很大的情況，那今天就來(lái)談一談質(zhì)量精度。什么是質(zhì)量精度？質(zhì)量精度指的是質(zhì)譜測(cè)得值和理論值之間的誤差。常以mDa或者ppm表 示。舉個(gè)例子：C6H12O6理論精確分子量為180.0634，如果測(cè)得分子量為180.0631，則誤差為180.0631-180.0634=-0.0003Da=-0.3mDa或者（180.0631-18

15、0.0634）/180.0634=1.67e-6 即 1.67ppm在液質(zhì)聯(lián)用中，化合物通常是以加合離子的形式出現(xiàn)，如M+H +，M+Na+等，以上 只是舉例說(shuō)明。那么，如何保持較高的質(zhì)量精度呢？所有的高分辨質(zhì)譜在使用之前都需要對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，這個(gè)校正其實(shí)就是校正質(zhì)譜的 質(zhì)量軸。就像我們使用十萬(wàn)分之一天平時(shí)用一個(gè)200克的祛碼對(duì)天平進(jìn)行校正一樣，質(zhì)譜的 校正也是使用一系列已知分子量的物質(zhì)（覆蓋了從低到高的質(zhì)量范圍）對(duì)其進(jìn)行校正?？梢?接受的偏差通常為2ppm，校正的頻率依實(shí)際情況而定，Q-TOF質(zhì)譜大多數(shù)一周校正一次， Orbitrap質(zhì)譜校正的頻率稍少一些。各大儀器廠商常用的校正液如下：編

16、輯版word安攆倫Q-TQF質(zhì)譜ESI調(diào)諧海，備件時(shí) 仃姬虬昭EKWPflMtiTCNegativeMass 1lj與骷255I12B5S7M般C式工四陽(yáng)213O1W139Mihiu 3622.02m0601.978977Mjxs 4里工口的型INVARS 1 (KJMass 5122I.9906A7im.wMass 61521.J71475LQ394”觸V&SiS ?12I 4S233 31931930624Ysig 2122.9331512因3 mMass 9M2L9L的州25J3.S9230Mass JO272I.XA4K2923J3；R73139熱電。ritmp質(zhì)詣A.2 ESI校正液

17、：蜘啡因，MRFA, Ultranmrk 1621準(zhǔn)備ui校正液，如艮I網(wǎng)取加帕1咖啊國(guó)儲(chǔ)液到二個(gè)卜凈的廣燥的10ml體叔的玻璃瓶?jī)?nèi)*2200U MRFA拜液J液地眼”上工嚶 IMulUltmgik 1621 儲(chǔ)液#小，1.1 *, r，七-=.、：寤.打邛打叮；.卜代：；-門.，-.,- f.- 催4ajjl人為集.4JBU00U1詠醋酸J玻瑞版中.帙5M乙幅玻璃瓶中*6用他50的甲悵 木港濃將成電瓶的溶液體積補(bǔ)平仁1。加制堆提*.充分混勺校正液口乩將漆液裝入F凈的小瓶9. fl :小瓶I；標(biāo)記蟋7 CiiiitNWitm SoMn魄伴中備”1法特世Q-T0F使用的是甲酸鈉溶液.裝二代第組亨

18、某鳥(niǎo)團(tuán)此外，幾乎所有的Q-TOF質(zhì)譜除了在檢測(cè)之前進(jìn)行質(zhì)量軸校正外，在質(zhì)譜運(yùn)行過(guò)程中還需 要對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。編輯版word安捷倫Q-TOF質(zhì)瑁參比離漆列表止離子負(fù)離子68.99575812.9855K712L050873119.036320922.0097 gx1033.9 時(shí) 109沃特世Q-TCIF質(zhì)譜使用LE作為實(shí)時(shí)校正液日在正奐離子模式下分辨產(chǎn)生質(zhì)荷比為：55 6N 771 和 554N615 的離子.二.W,徹河招團(tuán)在非目標(biāo)代謝組學(xué)中，代謝物的鑒定通常依賴精確分子量，同位素分布等信息，儀器的 數(shù)據(jù)處理軟件通?？梢愿鶕?jù)采集到的質(zhì)譜圖對(duì)其元素組成進(jìn)行推測(cè)，方便化合物的鑒定，推 測(cè)的前提就是質(zhì)量精度要高，在進(jìn)行推測(cè)時(shí)通常需要輸入一個(gè)可以接受的誤差范圍（如士 5ppm），所以在質(zhì)譜使用之前一定要對(duì)其進(jìn)行校正，或者一定保證質(zhì)譜的質(zhì)量軸是準(zhǔn)確的。在代謝組學(xué)文章投稿時(shí)，都需要列出已鑒定化合物的檢測(cè)分子量的誤差，這個(gè)通常需要 自己計(jì)算，計(jì)算方法如上述例子。這里介紹一個(gè)計(jì)算精確分子量的網(wǎng)站： HYPERLINK / /ChemCalc 0I”I Institute of ch