基于圖像分析的DNA定量分析研究

1、基于圖像闡發(fā)的DNA定量闡發(fā)研究【關(guān)鍵詞】DNA摘要：目的運(yùn)用IIageyteter對(duì)圖像舉行處置懲罰和闡發(fā)，在給出細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)的同時(shí)對(duì)DNA的含量舉行定量闡發(fā)，能有用地幫助大夫?qū)χT如腫瘤等多種病癥做出診斷。要領(lǐng)以武漢大學(xué)光譜與成像儀器工程技能研究中央研制的“全主動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量闡發(fā)儀DNAI為平臺(tái)，對(duì)雞血紅細(xì)胞和宮頸脫落細(xì)胞舉行液基薄層制片，用Feulgen染色法染色，對(duì)DNAI上獵取的細(xì)胞染色圖像舉行扣背底算法處置懲罰。結(jié)果用冷酸解法對(duì)兩種細(xì)胞舉行Feulgen染色后細(xì)胞著色較深且勻稱；舉行扣背底算法處置懲罰后的細(xì)胞圖像的灰度值方差為0.524，比不舉行處置懲罰時(shí)0.919要校結(jié)論冷

2、酸解法更有用于雞血紅細(xì)胞和宮頸脫落細(xì)胞的Feulgen染色；扣背底算法可以有用地淘汰視場(chǎng)不勻帶來的偏向。關(guān)鍵詞：DNAI；DNA定量闡發(fā)；扣背底；積分光密度；DI直方圖；Feulgen染色ResearhfDNAQuantitativeytlgyBasednIagePressingKeyrds：DNAI;DNAquantitativeytlgy;Distratingbakgrund;Integralptialdensity;DItable;Feulgenlratin20世紀(jì)90年代初至今，盤算機(jī)本錢的落落以及性能的大幅度革新、D技能和圖像處置懲罰技能的生長(zhǎng)，使得I技能在癌癥早期診斷的細(xì)胞DNA定

3、量闡發(fā)技能中異軍突起。其原理是醫(yī)學(xué)病理上常用的細(xì)胞切片、印片或涂片，經(jīng)結(jié)實(shí)液結(jié)實(shí)后用Feulgen染色，使用細(xì)密透射光學(xué)顯微鏡、窄帶干預(yù)干與濾光片、高精度圖像網(wǎng)羅體系將細(xì)胞DNA的數(shù)字化灰度圖像攝入盤算機(jī)，通過圖像處置懲罰技能對(duì)該細(xì)胞DNA圖像灰度形態(tài)舉行定量闡發(fā)，盤算出每個(gè)細(xì)胞的積分光密度ID值，再根據(jù)BeerLabert光汲取定律將單個(gè)細(xì)胞的ID值與尺度定標(biāo)細(xì)胞比擬后，換算成細(xì)胞DNA的絕對(duì)證量并給出被測(cè)細(xì)胞的倍體漫衍及細(xì)胞周期即G0/G1期，S期，G2/期等參數(shù)。醫(yī)師借助這些參數(shù)即可作出診斷。此要領(lǐng)輕便、有用并且正確度高，對(duì)人體及別的動(dòng)物腫瘤或癌癥的早期病理闡發(fā)和診斷研究具有龐大參考意義

4、。I(Iageyteter)不但能對(duì)少少量的細(xì)胞核作DNA含量和倍體闡發(fā)，并且可同時(shí)丈量細(xì)胞核的形態(tài)參數(shù)面積、形態(tài)因子、紋理特性等并通過圖像處置懲罰技能加以幫助闡發(fā)。因此I及其儀器在國(guó)際上漸漸在病理診斷學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、構(gòu)造胚胎學(xué)、遺傳免疫學(xué)等范疇得到了越來越普及的應(yīng)用，已經(jīng)成為DNA定量丈量，尤其是腫瘤的細(xì)胞學(xué)診斷的一項(xiàng)快速、客不雅、有用的緊張本領(lǐng)1，2。近幾年來，用DNA倍體闡發(fā)體系舉行宮頸癌及癌前病變的診斷在外洋已有大量報(bào)道310。別的，細(xì)胞DNA定量闡發(fā)診斷要領(lǐng)在北美及歐洲已作為一種通例臨床檢測(cè)要領(lǐng)之一1113。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1質(zhì)料宮頸脫落細(xì)胞樣本取自湖北省武漢市腫瘤病院、湖北省黃石市

5、第一病院和山東淄博籌劃生養(yǎng)研究所，保存于50%的乙醇溶液細(xì)胞保存液中。雞血紅細(xì)胞取自康健公雞的動(dòng)脈血，參加0.3%0.4%的檸檬酸鈉抗凝劑，保存于50%的乙醇溶液細(xì)胞保存液中。1.2要領(lǐng)接納液基薄層制片技能，對(duì)制作的玻片舉行Feulgen染色，再使用全主動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量闡發(fā)儀完成對(duì)細(xì)胞圖像的網(wǎng)羅、處置懲罰和DNA定量闡發(fā)。圖1全主動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量闡發(fā)儀硬件組成略圖2DNA定量闡發(fā)的流程略扣背底算法：為了落服光學(xué)通報(bào)中的不勻稱性，我們網(wǎng)羅了一幅空視野作為亮場(chǎng)背底圖像，然后在反面網(wǎng)羅的細(xì)胞圖像中撤除這個(gè)背底圖像，用這種要領(lǐng)可以有用地淘汰視場(chǎng)不勻帶來的偏向。全局扣背底為丈量細(xì)胞圖像闡發(fā)儀的光

6、勻稱度，在玻片上探求一個(gè)空缺位置染色后的背底，一樣平常還會(huì)有少量的雜質(zhì)網(wǎng)羅一幅背底圖像，背底圖像的灰度漫衍不勻稱見圖3，其灰度直方圖也不是規(guī)矩的單峰，這是與顯微鏡的光路體系直接相干的，假設(shè)不接納軟件體系舉行校正，會(huì)帶來極大的丈量偏向。勻稱度指配景光強(qiáng)的灰度尺度差和變異系數(shù)effiientfvariatin。它們形貌了配景光的勻稱性，要求配景圖像的像素點(diǎn)灰度變異系數(shù)小于3%。其公式如下：sd=1Ni=1Nj=1fij(x,y)-f(x,y)21/21V=sdf(x,y)此中sd為圖像各個(gè)像素灰度的尺度差，fij(，y)為某一個(gè)像素點(diǎn)的灰度值0255，f(x,y)為圖像全部像素灰度的均勻值，N別離

7、是圖像的長(zhǎng)和寬。v為圖像各個(gè)像素灰度的變異系數(shù)。圖3網(wǎng)羅的背底圖像略圖4背底圖像支解結(jié)果圖略圖5變異系數(shù)略由圖4可見，由于背底圖像的灰度漫衍不勻稱，二值化后的圖像存在不規(guī)矩邊沿圖中藍(lán)色表現(xiàn)配景中灰度值較小的地區(qū)。圖5中，其直方圖的第1個(gè)峰為某處視場(chǎng)舉行扣背底后盤算的像素點(diǎn)灰度值變異系數(shù)1.08%，第2個(gè)峰為未扣背底盤算的變異系數(shù)3.82%，第3個(gè)峰為尺度劃定的變異系數(shù)最大值3%?？鄢植勘车椎囊I(lǐng)與全局扣背底雷同。一樣平常是將細(xì)胞的外接矩形擴(kuò)展2個(gè)像素，然后在此范疇內(nèi)盤算除了細(xì)胞的有用像素之外的全部配景像素的灰度均勻值，并以此均勻值作為均勻背底在細(xì)胞的每個(gè)有用像素中扣除?？鄢惴梢杂孟喑蛳?/p>

8、減本DNAI步伐中用相除。由于雞血紅細(xì)胞比宮頸脫落細(xì)胞小得多，且有的細(xì)胞毗連較細(xì)密，接納將細(xì)胞的外接矩形擴(kuò)展2個(gè)像素的要領(lǐng)會(huì)使外擴(kuò)地區(qū)中包羅其他雞血紅細(xì)胞的有用像素，從而在盤算積分光密度時(shí)產(chǎn)生偏向，以是接納外擴(kuò)1個(gè)像素的要領(lǐng)。2結(jié)果2.1冷酸法Feulgen染色后的結(jié)果20倍鏡下經(jīng)45in酸解的雞血紅細(xì)胞在全主動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量闡發(fā)儀中網(wǎng)羅的圖像如圖68所示。由圖可見，細(xì)胞邊沿清楚，著色勻稱，結(jié)果優(yōu)于熱酸法。圖6原始細(xì)胞圖像略圖7背底圖像v=1.62%略圖8全局扣背底后的圖像略2.220倍鏡下雞血紅細(xì)胞積分光密度直方圖的比力20倍鏡下經(jīng)45in酸解的雞血紅細(xì)胞十個(gè)視場(chǎng)，共1500個(gè)細(xì)胞別離根

9、據(jù)下面四種差異的要領(lǐng)舉行實(shí)行，并比力實(shí)行結(jié)果見圖9。結(jié)果見表1。由表1可以得出：ID離散程度全局扣背底加局部扣背底時(shí)最校抱負(fù)的玻片背底是勻稱的，但現(xiàn)實(shí)上由于經(jīng)Feulgen染色后玻片上殘留染色物質(zhì)的漫衍不均和照明光源的不勻稱性，使得玻片背底現(xiàn)實(shí)的灰度漫衍不勻稱。假設(shè)不扣除這種不勻稱性，在玻片差異位置大概是視場(chǎng)的差異位置測(cè)得的雷同細(xì)胞核的灰度值差異，盤算出的ID值也會(huì)受影響。而全局扣背底大要上去除了配景的不勻稱性造成的影響。再舉行一次局部扣被底，把配景不勻稱性的影響再次減小，以是此時(shí)得到的ID的主峰細(xì)密程度最好，離散程度最小；ID方差各不雷同，此中全局扣背底比不全局扣背底所得的方差要校這也是由于

10、全局扣背底大要上去除了配景的不勻稱性造成的影響。表14種扣背底要領(lǐng)的比力略圖9略1全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞ID直方圖；2全局不扣背底、局部扣背底后細(xì)胞ID直方圖；3全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞ID直方圖；4全局不扣底、局部不扣背底后的細(xì)胞ID直方圖。坐標(biāo)系中橫坐標(biāo)表現(xiàn)ID值，縱坐標(biāo)表現(xiàn)細(xì)胞個(gè)數(shù)2.3宮頸脫落細(xì)胞DIDNAIndex,DNA指數(shù)直方圖、散點(diǎn)圖20倍鏡下的正凡人體宮頸細(xì)胞和產(chǎn)生癌變的人體宮頸細(xì)胞全局扣背底、局部扣背底DI直方圖、散點(diǎn)圖的比力見圖10。圖10略1、2正凡人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點(diǎn)圖；3、4產(chǎn)生癌變的人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點(diǎn)圖直方圖中橫坐標(biāo)表現(xiàn)DI值，縱坐標(biāo)表現(xiàn)細(xì)

11、胞個(gè)數(shù)；散點(diǎn)圖中橫坐標(biāo)表現(xiàn)DI值，縱坐標(biāo)表現(xiàn)細(xì)胞核面積由于宮頸脫落細(xì)胞比雞血紅細(xì)胞大得多且DNA含量較不變，以是正凡人體細(xì)胞ID直方圖中ID值的離散程度更小約90%的細(xì)胞在主峰的正負(fù)10%范疇內(nèi)，DI值的主峰更細(xì)，體系丈量的結(jié)果更正確。由于產(chǎn)生癌變的細(xì)胞中DNA含量增長(zhǎng)，DI值大于2的細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著增多，大夫可以根據(jù)DI值來斷定細(xì)胞的癌變程度并作出診斷。3結(jié)論細(xì)胞DNA定量闡發(fā)對(duì)從硬件平臺(tái)到軟件算法都有著極為嚴(yán)酷的要求，以包管定量闡發(fā)的精度和診斷結(jié)果正確性。DNA定量闡發(fā)的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞的積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)面積、外形因子等的正確丈量。此中第一步就是要獵取正確、清楚的圖像，這就對(duì)細(xì)胞制片和染色環(huán)

12、節(jié)提出了嚴(yán)酷的要求。液基薄層制片技能的運(yùn)用，F(xiàn)eulgen染色中冷酸法的選擇包管了所制玻片完全滿意DNA定量闡發(fā)的必要。在細(xì)胞積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)丈量之前對(duì)細(xì)胞圖像舉行扣背底處置懲罰，很好的消除了顯微鏡光路體系帶來的丈量偏向，落服了光學(xué)通報(bào)中的不勻稱性，使得細(xì)胞積分光密度的測(cè)定越發(fā)正確。參考文獻(xiàn)：1徐元.I技能研究希望及其應(yīng)用遠(yuǎn)景J.有用腫瘤雜志，1999，141：3.2張亞偉，沈鎮(zhèn)廟.圖象闡發(fā)法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞DNA含量及其意義J.外科雜志，1997，21：16.3BkingA,AdlerP,nHH,etal.AlgrithfrDNAytphtetridiagnsisandgradingfa

13、lignanyJ.AnalQuantytl,1984,6(1):1.4B?kingA,Hilgarth,Aufferann,etal.DNA-ytetridiagnsisfprspetivealignanyinbrderlinelesinsftheuterineervixJ.Ataytl,1986,30(6):608.5GrteHJ,FriedrihsN,PjanskiN,etal.PrgnstisignifianefDNAytetryinarinaftheuterineervixFIGStageIBandIIJ.AnalellPathl,2001,23(3):97.7hatelainR,Sh

14、unkT,ShindlerE,etal.DiagnsisfprspetivealignayinkilytidysplasiaftheervixithDNAytetryJ.JReprded.1989，34:505.8KashyapV,DasDK,LuthraUK.irphtetrinulearDNAanalysisinervialdysplasiftheuterineervix:itsrelatinttheprgressintalignanyandregressintnralJ.Neplasa.1990，37：487.9BllannR,bkingA.PrgnstivalidityfDNA-iaging-ytetryinervialdysplasiasJ.VerhDtshGesPath.1996，80：557.11Trsten.Reerbah,HrstEidenbah,NataljaPjanski,KristinaeKnps,S