質(zhì)粒構(gòu)建步驟設(shè)計(jì)

1、ALS相關(guān)基因蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建材料：含有GST載體pGEX-6p-1的菌（約5kb）； SMNld （大約1kb）和C9ORF72 （大 約 1.5kb）基因；BamH1 和 EcoR1 酶 Cutsmart。步驟：目的基因的獲得1、引物設(shè)計(jì)SMNld TRANSCRIPTION-BGGATatggcgatgagcagcggc 27b75.17Csmnld TRANSCRIPTION-gGAATTTAATTTAAGGAATGTGA27b59.09CC9ORF72 FGTGGATATGTCGACTCTTTGCCCA27b66.98CC9ORF72 RGCGAATttaaaaagtcattaga

2、ac33btcg63.44C2、將含有目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行PCR.（ ul）編號(hào)模板復(fù)合物引物F/RddH2O目的基因模板濃度12102210SMN未稀釋2010221032102210C9ORF72未稀釋4010221050.2102210SMN1/10060.5102210SMN1/10070.2102210C9ORF721/10080.5102210C9ORF721/1003、DNA電泳（1g瓊脂糖/100m1XlTAE）以檢測PCR產(chǎn)物。0 1 2 3 4 5 6 7 84、跑膠并回收5號(hào)和6號(hào)（SMN）共40u l全部加到一號(hào)孔中7號(hào)和8號(hào)（C9ORF72）共40ul全部加到三號(hào)孔中五

3、號(hào)孔加5 u lMarker回收:1、在紫外光下將目的帶切下，放入兩個(gè)EP管中2、每管中加 250 ul Binding Buffer, 60C,7 分鐘融化3、將溶化后的膠加入到柱子中；10000 xg 1min離心，棄液4、加 300 u IBinding Buffer,10000 xg 1min 離心，棄液5、加700 u 1SPW洗兩次，10000 xg 1min離心、，棄液6、12000 xg，2mi口離心，揮干乙醇7、超凈臺(tái)內(nèi)吹2min8、加 30u1ddH2O 靜置 1min，10000 xg 1min 離心、9、重溶解一遍質(zhì)粒的獲得：1、擴(kuò)大培養(yǎng)：將菌種接種(20 ul)到含有

4、AMP(5 ul)的培養(yǎng)基(5ml)上， 37C搖過夜。2、提質(zhì)粒：1、收集50-100ml過夜培養(yǎng)的菌液10000rpm離心、1分鐘，盡量 吸除上清2、向留有菌體沉淀的離心管中加入250 u l溶液I，使用移液器 或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。3、向離心、管中加入250 u l溶液II，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌 體充分裂解。注意：翻轉(zhuǎn)一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA。作用時(shí)間不要超過2分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。4、向離心、管中加入350 u l溶液III，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5、20000rpm 離心、10 分鐘。6、將上一步所得上清液加入吸

5、附柱中（吸附柱加入收集管中）， 室溫放置2-3分鐘，10000rpm離心、30-60秒，倒掉收集管中的廢液， 將吸附柱重新放回收集管中。7、向吸附柱中加入500U1HB清洗，10000rpm離心、1分鐘，倒 掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。8、向吸附柱重加入700 U1WB，10000rpm離心、1分鐘，棄掉收 集管中的廢液。9、重復(fù)810、將吸附柱放回收集管中，15000rpm離心2分鐘，將吸附柱 置于室溫放置3-5分鐘，揮發(fā)乙醇。11、將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸 空滴加30洗脫液緩沖液或去離子水，室溫放置2分鐘，10000rpm離 心1分鐘將質(zhì)粒溶液收

6、集到離心管中。12、測濃度或跑膠驗(yàn)證并在-20笆保存。（將1U1的loading與 1U1的質(zhì)?；旌宵c(diǎn)樣）載體構(gòu)建1、雙酶切目的基因和質(zhì)粒（單位U1）序號(hào)BamHlEcoRlCutsmartSMNC9ORF72p-GEX1223.630002223.603003223.60030每個(gè)體系37.6u1，37C水浴4h。2、連接2u1 載體+6u1 目的片段+1U1T4 Buffer+0.5 u 1T4 酶+0.5u1 水 共10u1室溫1h四、轉(zhuǎn)化與篩選：將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)宿主細(xì)胞中并接種于含有Amp的培養(yǎng)基中，篩選導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)胞。1、取感受態(tài)大腸桿菌在冰上融化2、將酶連產(chǎn)物全部加入感受態(tài)

7、中，混勻，在冰上放置30min3、42C熱激90s，馬上放在冰上，放置3min4、加750 u 1無抗LB，37C搖床搖45min5、5000 xg離心、4min，棄650 u1上清重懸6、將上述菌液搖勻后取100u1涂布于含Amp的篩選平板上，37C培養(yǎng)箱過夜SMNC9ORF72空白質(zhì)粒（AMP持續(xù)效率只有十七個(gè)小時(shí)左右，所以不能培養(yǎng)時(shí)間過長）五、 目的基因檢測1、挑取單菌落接種于含AMP的LB中，37笆搖床擴(kuò)大培養(yǎng)，過夜2、做PCR或酚氯仿快檢重組質(zhì)?？鞕z的具體方法快檢就是直接用搖起的菌液取100uL,加50uL的苯酚和50uL的氯仿渦旋離心，取上清跑膠，對照上個(gè)空載體，3、跑膠并確定目的

8、菌（點(diǎn)樣2ul）M 01 2 34 5 67 8 9 10 11 M SMN-PCRM 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 0C9ORF72-快檢M C9ORF72-PCRSMN： 2 號(hào)C9ORF72： 1 號(hào)和 6 SMN： 2 號(hào)4、測序，保菌，提質(zhì)粒。C Q G 心以心 C Q G 心以心 G aGG A 1 CC GT GCTGTT CC GGCG CGGC aCA C GC Ca G AG CGn! UUM.JAU-AT TCT GACaT TTG GG AT G *1 aCA Q CACT G AT aA A A SCAT AT感受態(tài)的制備.：接菌到加有5 ml LB培養(yǎng)

9、基的15 ml離心管中擴(kuò)大培養(yǎng)，37C搖床過夜。將過夜所得到的菌液接種到含250 ml LB的1 L錐形瓶中,37C培養(yǎng)至OD值為0.40.6。用50 ml離心管分裝，4C, 4500 g離心10 min,棄上清（此步往下在冰上操作）。用30ml 0.1mol/L的氯化鈣輕柔重懸。5.4C, 4500 g 離心 10 min。棄上清，加2ml氯化鈣重懸，加甘油（甘油最終濃度為20%）。分裝1.5 ml EP管中，每個(gè)50 UL，-80C儲(chǔ)藏。轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，在不包含抗生素的適量的培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的 匯合度要達(dá)到70 - 90 %。準(zhǔn)備復(fù)合物：100閆不包含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基+mg質(zhì)粒；100M不包含血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基+5M Lipofectamine，孵育五分鐘；輕輕混勻后在室溫下再孵育15分 鐘。將復(fù)合物加入到每一個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動(dòng)培養(yǎng) 板混合。37 C，CO2培養(yǎng)箱孵育，在轉(zhuǎn)