生物制藥-第三章-基因工程制藥-基因工程藥物制造實例和質量控制課件

1、第八節(jié)基因工程藥物制造實例 一、干擾素 二、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 三、人白細胞介素-2 四、美洲商陸抗病毒蛋白第八節(jié)基因工程藥物制造實例 一、干擾素 干擾素（interferon，IFN）是人體細胞分泌的一種活性蛋白質，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據分子結構和抗原性的差異分為、等4個類型。型干擾素在分為1b，2a ，2b等亞型，其區(qū)別表現在個別氨基酸的差異上。 干擾素（interferon，IFN）是人體細胞分一、基因工程菌的組建構建干擾素工程菌流程圖一、基因工程菌的組建構建干擾素工程菌流程圖一、干擾素基因工程菌的組建流程誘生的白細胞 提取全

2、RNA 通過寡dT-纖維素柱 蔗糖密度梯度 獲得寡A的mRNA 離心提取12s 的 mRNA 逆轉錄成cDNA 雙鏈cDNA接上dT或dG尾 pBR322質粒 pBR322質粒加上dA或dC一、干擾素基因工程菌的組建流程 退火獲的雜交質粒 轉化大腸桿菌 擴增雜交質粒 篩選抗青霉素但對氨芐 青霉素敏感細菌克隆用雜交翻譯法挑選含干擾素cDNA克隆 將干擾素cDNA克隆入表達載體 在大腸桿菌中進行高效表達生物制藥-第三章-基因工程制藥-基因工程藥物制造實例和質量控制課件二、基因工程干擾素的制備啟開種子 制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng) 粗提精提 半成品制備 半成品檢定 分裝凍干 成品檢定 成品包裝制備基因工程干

3、擾素的工藝流程圖二、基因工程干擾素的制備制備基因工程干擾素的工藝流程圖三、人2b型干擾素(hIFN2b)工程菌株的組建過程應用PCR的方法，從人的染色體片段制備人2b干擾素的cDNA，將其克隆到pRC23表達載體上，構建成重組表達質粒pMZI2B，并轉化大腸桿菌DH5a，組建成工程菌株。由于pMZI2B的2b基因5端起始密碼ATG上游編制了一段SD順序，與PL啟動子上連接的SD順序組成雙SD順序，所以克隆基因的表達水平有明顯的提高。三、人2b型干擾素(hIFN2b)工程菌株的組建過程應1. hIFN-2b基因的獲得 用于克隆的人2b干擾素基因是應用PCR方法從帶有人2b干擾素基因的染色體片段獲

4、得的：模板DNA 4ng，引物為50pmol/L，各25L 4dNTP 4L，TaqDNA聚合酶2.5L，10PCR反應緩沖液10L，補水使總反應體積為100L。反應條件：變性溫度為94 ，退火溫度為50，鏈延伸溫度為72 。共30個循環(huán)。1. hIFN-2b基因的獲得采用PCR技術擴增的人2b干擾素基因片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，其片段大小約相當于0.55kb。將該片段插入質粒pGEM-3的EcoR I和BamH I的位點上，轉化大腸桿菌DH5a，培養(yǎng)后提取質粒DNA，用引物SP6和T7從兩端測定DNA順序。結果證明其順序與文獻報道的基因順序是一致的。采用PCR技術擴增的人2b干擾素基因

5、片段，經1%瓊脂糖凝膠2重組表達質粒pMZI2B的構建 pGEM-32bB質粒經EcoR I和BamH I雙酶解，切下2b-B片段，純化后克隆到質粒pRC23的EcoR I和BamH I位點上，構建成重組表達質粒pMZI2B(見圖)。2重組表達質粒pMZI2B的構建3人2b型干擾素工程菌株的形成與基因的表達 將重組表達質粒pMZI2B轉化大腸桿菌DH5a形成工程菌。經37 搖床培養(yǎng)后進行抗病毒活性檢測。3人2b型干擾素工程菌株的形成與基因的表達結果表明，具有雙SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.69x104IUmL)，與僅具有單SD序列的pMZI2A(其組建過程同上)的抗病毒活性(3.46

6、xl03IUmL)相比，有顯著的提高。這是因為基因的表達水平與轉錄和翻譯兩個主要環(huán)節(jié)密切相關，而SD序列在蛋白質翻譯中是核糖體的識別和結合部位，因此，增加SD序列，即增加了蛋白質翻譯時核糖體的識別和結合機率。結果表明，具有雙SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.692b干擾素的生產4.發(fā)酵 工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，質粒用PL啟動子，含氨芐青霉素抗性基因。培養(yǎng)基含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。搖床培養(yǎng)30，10h，培養(yǎng)發(fā)酵罐種子。15L發(fā)酵罐培養(yǎng)， 30 ，8h。然后42 ，2-3h即可完成發(fā)酵。每隔2h取樣測OD或離心去上清稱量菌體濕重。2b干擾

7、素的生產 4.產品的提取與純化 4,000r/min離心30分鐘，去上清，得濕菌泥。 濕菌超聲破碎，離心，取沉淀部分，溶液處理，離心取上清液，上清超濾濃縮， Sephadex G50 分離。 經SDS檢查。 再經DE-52柱純化人干擾素2b。 4.產品的提取與純化質量控制標準和要求 半成品檢定干擾素效價測定蛋白質含量測定比活性純度測定相對分子量測定殘余外源性DNA含量測定殘余血清IgG含量測定質量控制標準和要求 半成品檢定殘余抗生素活性測定紫外光譜掃描肽圖測定等電點測定除菌半成品應做干擾素效價測定、無菌試驗、熱原質試驗。 殘余抗生素活性測定 成品檢定物理性狀鑒別試驗水分測定無菌試驗熱原試驗干擾

8、素效價測定安全試驗 美洲商陸 成品檢定物理性狀第九節(jié) 基因工程藥物的質量控制基因工程藥物與傳統(tǒng)意義上的一般藥品的生產不同，首先它是利用活的細胞作為表達系統(tǒng)，所獲蛋白質產品往往相對分子質量較大，并具有復雜的結構；許多基因工程藥物還是參與人體一些生理功能精密調節(jié)所必需的蛋白質，極微量就可產生顯著效應(每劑量的用量：白介素-12僅0.1 g， 干擾素也只有1030 g)，任何藥物性質或劑量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴重危害。第九節(jié) 基因工程藥物的質量控制基因工程藥物與傳統(tǒng)意義上的一基因工程藥物需要在宿主細胞中表達的外源基因，在轉錄或翻譯、精制、工藝放大過程中，都有可能發(fā)生變化，所以從原料制備過

9、程產品的每一步都必須嚴格控制條件和鑒定質量，確保產品符合質量標準、安全有效?；蚬こ趟幬镄枰谒拗骷毎斜磉_的外源基因，在轉錄或翻譯、精一、原材料的質量控制 原材料的質量控制是要確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質粒純而穩(wěn)定，以保證產品質量的安全性和一致性。一、原材料的質量控制應該了解：需要明確目的基因的來源、克隆經過、限制性內切酶酶切圖譜、核苷酸序列；應提供表達載體的名稱、結構、遺傳特性及其各組成部分(如復制子、啟動子)的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標志物；應提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及其生物學特性等；應該了解：需闡明載體引人

10、宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內的狀態(tài)，如是否整合到染色體內及在其中的拷貝數、宿主細胞與載體結合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達載體兩側端控制區(qū)內的核苷酸序列，在生產過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法及水平等。需闡明載體引人宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內的狀態(tài)，如是二、培養(yǎng)過程的質量控制 在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復生產發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。二、培養(yǎng)過程的質量控制 三、純化工藝過程的質量控制 產品要有足夠的生理和生物學試驗數據，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質、DNA與

11、熱原質都控制在規(guī)定限度以下。在精制過程中避免宿主細胞蛋白質、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分等的污染，并用相應的方法進行檢測。 三、純化工藝過程的質量控制四、目標產品的質量控制需要綜合利用生物化學、免疫學、微生物學、細胞生物學和分子生物學等多門學科的理論與技術所建立起來的鑒定方法，以保證基因工程藥品安全有效。四、目標產品的質量控制1、產品的鑒定肽圖分析氨基酸成分分析部分氨基酸序列分析重組蛋白質的濃度和相對分子質量測定蛋白質二硫鍵分析1、產品的鑒定重組蛋白質藥物產品常用的鑒定方法重組蛋白質藥物產品常用的鑒定方法2純度分析純度分析是基因工程藥物質量控制的關鍵項目，它包括目的蛋白質含量測定和雜質限量分析

12、兩個方面的內容。(1)目的蛋白質含量測定 測定蛋白質含量的方法可根據目的蛋白質的理化性質和生物學特性來設計。通常采用的方法有還原性及非還原性SDS、等電點聚焦、各種HPLC、毛細管電泳(CE)等。2純度分析(2)雜質 基因工程產物的雜質包括蛋白質和非蛋白質兩類。通常需要檢測的雜質及其檢測方法見下表。(2)雜質 基因工程產物的雜質包括蛋白質和非蛋白質兩類?；蚬こ坍a物中常見雜質和污染物及其檢測方法基因工程產物中常見雜質和污染物及其檢測方法3生物活性測定 生物活性測定是保證基因工程藥物產品有效性的重要手段，往往需要進行動物體內試驗和通過細胞培養(yǎng)進行體外效價測定。3生物活性測定4穩(wěn)定性檢驗藥品的穩(wěn)定

13、性是評價藥品有效性和安全性的重要指標之一，也是確定藥品貯藏條件和使用期限的主要依據。采用恰當的物理化學、生物化學和免疫化學技術對其活性成分的性質進行全面鑒定，要準確檢測在貯藏過程中由于脫氨、氧化、磺?；?、聚合或降解等造成的分子變化。4穩(wěn)定性檢驗5產品一致性的保證 以重組DNA技術為主的生物制藥是一個十分復雜的過程，生產周期可達一個月甚至更長，影響因素較多。需要對原料生產產品的每一環(huán)節(jié)都進行嚴格的控制和質量檢定，才能確保各批最終產品都是安全有效、含量和雜質限度一致并符合標準。5產品一致性的保證五、產品的保存1、液態(tài)保存（1）、低溫保存（2）、穩(wěn)定pH條件下保存（3）、高濃度保存（4）、加保護劑保存五、產品的保存蛋白質的穩(wěn)定劑有糖類、脂肪類、蛋白質類、多元醇、有機溶劑等；有些蛋白質在高離子強度的極性環(huán)境下才能保持其活性，加入中性鹽可穩(wěn)定這些蛋白質；某些蛋白質表面或內部含有半胱氨酸巰基，容易被空氣中的氧緩慢氧化為次磺酸或二硫化物，使蛋白質的電荷或構象發(fā)生改變而失活，可加入-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等，在真空或惰性氣體中密閉保存。蛋白質的穩(wěn)定劑有糖類、脂肪類、蛋白質類、多元醇、有機溶劑等；2、固態(tài)保存 固態(tài)蛋白質比液態(tài)穩(wěn)定，一般蛋白質含水量降到5