生化藥物生產(chǎn)項目報告書范本

1、年4月19日生化藥物生產(chǎn)項目報告書范本文檔僅供參考姓名: 朱 鵬 飛學(xué)號: 040941姓名: 朱 鵬 飛學(xué)號: 040941班級:生物技術(shù)1211生化藥物生產(chǎn)項目報告書目 錄目 錄項目一:核酸的生產(chǎn)資料查找實驗方案制定PPT展示實驗報告實驗過程與結(jié)果圖片展示項目二:SOD的生產(chǎn)資料查找實驗方案制定PPT展示實驗報告實驗過程與結(jié)果圖片展示項目三:卵磷脂的生產(chǎn)資料查找實驗方案制定PPT展示實驗報告實驗過程與結(jié)果圖片展示項目四:香菇多糖的生產(chǎn)資料查找實驗方案制定PPT展示實驗報告實驗過程與結(jié)果圖片展示1.資料查找1.1核酸相關(guān)知識1.1.1核酸簡介由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,為生命的最基

2、本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸,其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。在一定理化因素作用下,核酸雙螺旋等空間結(jié)構(gòu)中堿基之間的氫鍵斷裂,變成單鏈的現(xiàn)象稱為變性。引起核酸變性的常見理化因素有加熱、酸、堿、尿素和甲酰胺等。變性DNA在適當(dāng)條件下,可使兩條分開的單鏈重新形成雙螺旋DNA的過程稱為復(fù)性1.1.2種類核酸同蛋白質(zhì)一樣,也是生物大分子。核酸的相對分子質(zhì)量很大,一般是幾十萬至幾百萬。核酸水解后得到許多核苷酸,實驗證明,核苷酸是組成核酸的基本單位,機組成核酸分子的單體。一個核苷酸分子是由一分子含氮的堿基(稱堿基)、一分子五碳糖

3、(即五碳糖)和一分子磷酸組成的。根據(jù)五碳糖的不同能夠?qū)⒑塑账岱譃槊撗鹾颂呛塑账?DNA)和核糖核苷酸(RNA)。DNA存在多級結(jié)構(gòu)DNA的一級結(jié)構(gòu)即由核苷酸聚合而成的生物大分子。DNA二級結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu)(double helix structure)。DNA三級結(jié)構(gòu)是指DNA鏈進一步扭曲盤旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)。DNA的四級結(jié)構(gòu)DNA與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物1.1.3作用核酸在蛋白質(zhì)的復(fù)制和合成中起著儲存和傳遞遺傳信息的作用。核酸不但是基本的遺傳物質(zhì),而且在蛋白質(zhì)的生物合成上也占重要位置,因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中起決定性的作用。DNA是儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基礎(chǔ),RNA在

4、蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用,其中轉(zhuǎn)運核糖核酸,簡稱tRNA,起著攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的作用;信使核糖核酸,簡稱mRNA,是合成蛋白質(zhì)的模板;核糖體的核糖核酸,簡稱rRNA,是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的主要場所。A.積極作用核酸在實踐應(yīng)用方面有極重要的作用,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近 種遺傳性疾病都和DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)。如人類鐮刀形紅血細(xì)胞貧血癥是由于患者的血紅蛋白分子中一個氨基酸的遺傳密碼發(fā)生了改變,白化病患者則是DNA分子上缺乏產(chǎn)生促黑色素生成的酪氨酸酶的基因所致。腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對機體的作用等都與核酸有關(guān)。70年代以來興起的遺傳工程,使人們可用人工方法改組DNA,從而有可能創(chuàng)造出新型的生物品種。如應(yīng)用遺傳

5、工程方法已能使大腸桿菌產(chǎn)生胰島素、干擾素等珍貴的生化藥物。核酸氧化分解后變成了磷酸和堿基的嘌呤和嘧啶,當(dāng)前還沒有發(fā)現(xiàn)嘧啶有何害處,但嘌呤是導(dǎo)致人類尿酸增高和痛風(fēng)的主要原因。B.消極作用核酸氧化分解生成嘌呤嘌呤在肝臟進一步氧化成為(2,6,8-三氧嘌呤)又稱為尿酸,尿酸鹽沉積到關(guān)節(jié)腔等組織引起痛風(fēng)發(fā)作。因此,核酸不是越多越好,同時,這也說明了為什么中老年易患痛風(fēng),因為年紀(jì)來了,大量的細(xì)胞死亡,而細(xì)胞內(nèi)有大量的核酸,生成嘌呤,再生成尿酸,從而導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)作。防治好痛風(fēng)就是要防止核酸被氧化。1.1.4核酸的組成核酸同蛋白質(zhì)一樣,也是生物大分子。核酸的相對分子質(zhì)量很大,一般是幾十萬至幾百萬。核酸由C、H

6、、O、N、P,5種元素組成。核苷酸是組成核酸的基本單位,是組成核酸分子的單體,核酸是核苷酸經(jīng)過3,5磷酸二酯鍵連接的。單個核苷酸是由含氮有機堿(稱堿基)、戊糖(即五碳糖)和磷酸三部分構(gòu)成的。堿基:構(gòu)成核苷酸的堿基分為嘌呤和嘧啶二類。嘌呤主要指腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G),DNA和RNA中均含有這二種堿基。嘧啶主要指胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U),胞嘧啶(C)為DNA和RNA共有,而胸腺嘧啶(T)只存在于DNA中,尿嘧啶(U)則只存在于RNA中。1.1.5 DNA與RNA的區(qū)別核酸DNARNA名稱脫氧核糖核酸核糖核酸結(jié)構(gòu)規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)一般呈單鏈結(jié)構(gòu)基本單位脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖

7、脫氧核糖核糖含氮堿基A(腺嘌呤)A(腺嘌呤)G(鳥嘌呤)G(鳥嘌呤)C(胞嘧啶)C(胞嘧啶)T(胸腺嘧啶)U(尿嘧啶)分布主要存在于細(xì)胞核,少量存在于線粒體和葉綠體主要存在于細(xì)胞質(zhì)功能絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì),攜帶遺傳信息,在生物體的遺傳、變異和蛋白質(zhì)的生物合成中具有極其重要的作用作為遺傳物質(zhì):只在RNA病毒中;不作為遺傳物質(zhì):在DNA控制蛋白質(zhì)合成過程中起作用。mRNA是蛋白質(zhì)是合成的直接模板、tRNA能攜帶特定氨基酸、rRNA是核糖體的組成成分;催化作用:酶的一種1.2核酸的制備核酸幾乎存在所有生物的細(xì)胞中,因此制備的原料多種多樣,采用的生物材料不同,制備的方法也會有所不同,但基本原理都是一

8、樣的。首先破碎細(xì)胞,釋放細(xì)胞內(nèi)容物,即釋放出核酸,常見的破碎細(xì)胞的方法有組織粉碎機、研缽、超聲波、酶處理、凍融法;然后除雜,應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括三部分(1)非核酸的大分子污染物:蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等 (2)非需要的核酸分子:分離某一特定的核酸分子時,其它的核酸分子皆為雜質(zhì);(3)加入的有機溶劑和某些金屬離子最后分理出核酸,當(dāng)然分離出核酸后,還能夠進一步純化。沉淀是分離核酸的最常見的方法常見的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂;常見的有機溶劑則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇,我們一般采用乙醇沉淀核酸。核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽,需用70%75%的乙醇洗滌去除1.3核酸的檢測

9、1.3.1 定性檢測RNA和DNA的顯色D核糖核酸濃鹽酸地衣酚反應(yīng)顯綠色D2脫氧核糖核酸酸二苯胺反應(yīng)顯藍(lán)紫色1.3.2 DNA的定量和純度測定常見的測定方法有:紫外分光光度法(此法要求核酸純度很高,1 個吸光度值相當(dāng)于50g mL 雙螺旋DNA; 除了定量測定以外還可進行核酸純度的檢測,A260 A280比值,純的DNA 為18,RNA 為20,樣品中含有蛋白質(zhì)和苯酚時,A26A280比值降低。)定糖法(DNA 糖部分為脫氧核糖,RNA 糖部分為核糖,分別能夠進行二苯胺顯色法和地衣酚顯色法);定磷法(測定核酸的磷酸部分)。這里著重二苯胺顯色紫外分光光度法(1) 原理DNA 在酸性條件下其嘌呤堿

10、與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂,生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸,而2脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成羥基酮基戊糖,與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì),在595nm波長處有最大吸收。DNA 在40400g 范圍內(nèi),光吸收與DNA 的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛,能夠提高反應(yīng)靈敏度。(2)DNA 吸光度的測定A260測定:以H2O 作為空白,取上清測A260值后確定稀釋倍數(shù),使A260值在20 左右(DNA此時的濃度約為100g mL。(由于二苯胺法的測定范圍是40400g mL DNA,因此DNA 濃度如果太小會影響測定結(jié)果)。A280測定:A260 A280比值計算。純的DNA 為18,RNA

11、為20。如果樣品中混有RNA,則比值大于18;如果樣品中混有蛋白質(zhì),則比值小于18。所用的DNA 溶液為前面提取后溶解的DNA 樣品。(3) DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和樣品測定加完各試劑后, 充分混勻。于60水浴中保溫1h,冷卻后于595nm 波長處以0 管為空白調(diào)零,測定各管光密度(OD595)。以DNA 的含量為橫坐標(biāo),光密度(吸收值)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(注:待測溶液中的DNA 含量應(yīng)調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)曲線的可讀范圍內(nèi)。樣品1 和樣品2 為不同稀釋倍數(shù)的DNA 溶液。)(4) DNA 含量計算以樣品的光密度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相對應(yīng)DNA 含量,并同紫外法測定的值進行比較。(注:二苯胺試劑具有

12、腐蝕性, 且二苯胺反應(yīng)產(chǎn)生的藍(lán)色不易褪色,操作中應(yīng)防止灑出;比色時,比色杯外面一定要擦干凈。)2.方案制定2.1核酸的制備(1)實驗原理在溶解細(xì)胞,核蛋白釋放后,根據(jù)DNA不溶于0.14mol/L NaCl溶液而RNA可溶的特性將DNA核蛋白與RNA核蛋白分離,得到粗品。粗品中主要成分為DNA和蛋白質(zhì),用氯仿、異戊醇進行抽提,可除去其中的蛋白質(zhì)。再加入一定量的異丙醇或乙醇,較長的基因組DNA分子將形成纖維狀絮團漂浮其中,而質(zhì)?；蚣?xì)胞器中的小分子DNA則只能形成顆粒狀沉淀物附著在容器壁或底部,用玻棒挑出纖維狀絮團即可達到比較滿意的分離效果,得到純度較高的基因組DNA。上清液中的RNA同樣也能夠采

13、用相同的方法提取,先用氯仿、異戊醇除去其中的蛋白質(zhì),再加入異戊醇或乙醇離心得到RNA沉淀。(2)實驗原料、試劑、器材與儀器實驗原料:新鮮豬肝實驗試劑:95%乙醇、氯仿、異戊醇,固體氯化鈉等器材與儀器:可見光光度計、紫外分光光度計、冷凍離心機、水浴鍋、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、離心管等。(3)操作步驟取新鮮豬肝少許,剪碎后洗去血水,加入2倍組織重的0.14mol/LNaCl-0.5mol/L檸檬酸混合液,用組織粉碎機粉碎,制得勻漿取10ml勻漿裝入離心管,平衡后于3500r/min離心15min,保留上層RNA提取液留著備用;在沉淀加入1mol/LNaCl,再次于3500r/min離心10mi

14、n;取上清液,加入氯仿和少許異戊醇3500r/min離心10min,得到蛋白質(zhì)沉淀,除去蛋白質(zhì)取上清液加1到2倍體積的95%乙醇攪拌,得到DNA沉淀在保留的上層RNA提取液中,加入氯仿和少量異戊醇,充分振蕩,然后3500r/min離心10min,得到蛋白質(zhì)沉淀 取上清液,加入1到2倍體積95%乙醇,離心,可得到RNA沉淀2.2核酸的檢測(1)RNA的鑒定,地衣酚顯色法 RNA與地衣酚會發(fā)生顯色反應(yīng),溶液變?yōu)榫G色,且顏色越深,說明RNA含量越多。將RNA 沉淀用2mL 蒸餾水溶解,然后轉(zhuǎn)移至2 只試管中,每只1mL。其中一只試管中加入3mL 地衣酚試劑,然后置沸水中20min,觀察顏色反應(yīng);另外

15、一只試管中加入2mL 二苯胺試劑,60條件下反應(yīng)1h,觀察顏色反應(yīng)。(2)DNA的鑒定,二苯胺顯色法 DNA會與二苯酚發(fā)生顯色反應(yīng),溶液會變成藍(lán)色,且顏色越深說明DNA含量越多。在DNA沉淀中加入1mol/LNaCl溶液或者蒸餾水溶解沉淀。各取上述1mL DNA 溶液于兩只試管中,其中一只里面加入3mL 地衣酚試劑,然后置沸水中20min,觀察顏色反應(yīng);另外一只試管中加入2mL 二苯胺試劑,60條件下反應(yīng)1h,觀察顏色反應(yīng)。3.PPT展示 1.資料查找1.1 SOD的基礎(chǔ)知識1.1.1簡介超氧化物歧化酶,別名肝蛋白、奧谷蛋白,簡稱:SOD。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì),能消除生物體在新陳代

16、謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對人體不斷地補充SOD具有抗衰老的特殊效果。1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶。1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白,而且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性,弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì),因此正式將其命名為超氧化物歧化酶。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內(nèi)的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敵,是機體內(nèi)氧自由基的頭號殺手,是生命健康之本。它在生物界的分布極廣,幾乎從人到細(xì)胞,從動物到植物,都有它的存在。1.1.2對人體的作用炎癥過程中產(chǎn)生的過氧化物游離基可造成機體的損害,SOD能促使過氧化物游離基轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧具有而有強大的

17、抗炎作用。O2具有細(xì)胞毒性,可使脂質(zhì)過氧化,損傷細(xì)胞膜,引起炎癥,腫瘤和自身免疫性疾病,并可能促使機體衰老,SOD為自由基清除劑,它廣泛存在于生物體的各種組織中,能清除自由基O2。(1)抑制心腦血管疾病機體的衰老與體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與積累密切相關(guān), SOD 可清除人體內(nèi)過多的有害的氧自由,是對健康的有益的功效成分。具有調(diào)節(jié)血脂的保健作用,可預(yù)防動脈粥樣硬化,預(yù)防高血脂引起的心腦血管疾病。降低脂質(zhì)過氧化物的含量。(2)抗衰老年齡的增長和某些體外因素會造成機體和皮膚組織自由基產(chǎn)生超過機體正常清除自由基的的能力,從而使皮膚組織造成傷害,導(dǎo)致衰老。由于SOD能夠清除自由基,因而能夠延緩衰老。人之因此會

18、衰老,老化跡象一點一滴出觀,如色素沉淀、體力衰退、是因為體內(nèi)產(chǎn)生氧化作用,所謂”氧化作用”就類似于生銹,抗氧化劑的補充有助于降低氧化的速度,減慢衰老的腳步。(3)防治自身免疫性疾病SOD對各類自身免疫性疾病都有一定的療效。如紅斑狼瘡、硬皮病、皮肌炎等。對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者應(yīng)在急性期病變未形成前使用,療效較好。(4)肺氣腫肺氣腫患者亦可使用 SOD ,但應(yīng)在病變初期肺彈性纖維尚未受到損害時使用,療效較好。(5)輻射病及輻射防護該品可用來治療因放療引起的膀胱炎、皮肌炎、紅斑狼瘡及白細(xì)胞減少等疾病,對有可能受到電離輻射的人員,也可注射 SOD 作為預(yù)防措施。(6)老年性白內(nèi)障對這類疾病應(yīng)在進入老年期

19、前即開始經(jīng)常服用抗氧化劑,或者說經(jīng)常注射SOD。一旦形成白內(nèi)障,則應(yīng)該摘除,因為此時使用SOD無效。(7)預(yù)防慢性病自由基是科學(xué)家最近才發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致各種慢性病與老化的罪魁禍?zhǔn)?故說它是”萬病之源”,是人體健康的大敵,自由基對身體的傷害是日積月累的,特別是糖尿病與心血管方面的疾病,林天送博士說:”照顧好您的心血管,就能夠活到九十歲?！别B(yǎng)成多多攝取抗氧化物的好習(xí)慣,保證能夠讓您遠(yuǎn)離慢性疾病的威脅。(8)抗疲勞過多的自由基在體內(nèi)殘存,就猶如毒素蓄積在體內(nèi)一樣,會讓人:容易疲勞、厭倦、注意力不集中、常?；杌璩脸?、打哈欠。SOD對上班族熬夜加班、學(xué)生應(yīng)付考試所產(chǎn)生的疲勞,在提振精神及集中注意力方面成效顯著,

20、有助于工作績效的提升,及考試成績的進步。(9)消除副作用,避免二次傷害手術(shù)會引起大量自由基, 而接受化療的癌癥病患體內(nèi)的抗氧化能力也會大大地降低,低到某個程度,自由基就會損害細(xì)胞、黏膜、五臟六腑、腦、中樞神經(jīng)等因此手術(shù)前后,癌癥患者口服抗氧化劑來迅速恢復(fù)體力,加速傷口復(fù)原。(10)化解女性的危機婦女的氧化危機有三:A.皮膚出現(xiàn)斑點皺紋:因為氧自由基無法有效被清除,破壞膠原蛋白、彈力纖維蛋白,使皮膚保濕及維持彈性的功能喪失,皺紋橫生,加速黑色素的沉淀;B.血液循環(huán)不良、經(jīng)期不順、黑眼圈、膚色灰暗無光澤;C.更年期障礙:因為動情激素的缺乏、體內(nèi)的抗氧化能力降低,常有以下癥狀出現(xiàn):陣發(fā)性朝熱、失眠、

21、夜間流汗、頭痛、情緒不穩(wěn)、心神不寧。1.1.3在生活中的應(yīng)用:SOD是生物體內(nèi)氧自由基的天然清除劑,具有廣泛的醫(yī)用價值,可作為藥品、食品及日化產(chǎn)品的添加劑。SOD 被批準(zhǔn)用于臨床使用,它對一些由于年齡、疾病或傷害造成的組織硬化以及纖維化顯示出強大的再生修復(fù)能力。SOD已被成功地應(yīng)用于放療后的輔助治療、控制心臟病人的進展、用于治療嚴(yán)重的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)病。在丹麥,有人經(jīng)過注射SOD 治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。超氧化物歧化酶廣泛應(yīng)用于化妝品添加劑方面,如利用超氧化物歧化酶制造的SOD面膜、SOD 蜜、SOD蛇粉等化妝品,當(dāng)前已有不下數(shù)百種產(chǎn)品。SOD 被作為一種補充食物,經(jīng)過動物研究發(fā)現(xiàn),口服SOD

22、在它發(fā)揮作用之前就已被消化系統(tǒng)破壞了。人們想盡各種可行的辦法使SOD在人體內(nèi)維持較高的水平,即在消耗食物的同時,提供合適的營養(yǎng)供肝臟合成SOD,或者直接將外源SOD 包裹在食物蛋白質(zhì)中,經(jīng)消化系統(tǒng)而不被消化,進入身體其它位置。1.2 SOD的制備SOD在生物體內(nèi)分布廣泛,能夠提取的原材料有很多,根據(jù)材料的不同,提取方法也會不同,這里我們著重介紹從大蒜中提取SOD的方法.(1)磷酸緩沖液提取法大蒜SOD 極性較大,易溶于水,根據(jù)”相似相溶”原理,可用水來浸取大蒜SOD。但磷酸緩沖液可提高浸取效能增加制品的穩(wěn)定性,減少雜質(zhì),因此實際操作中常采用pH 7.8 的磷酸緩沖液代替水來浸取大蒜SOD,得到

23、粗提取液。但該方法的缺點是浸出范圍廣,選擇性相對差,容易浸出大量的無效成分,且會引起一些有效成分的水解。(2) 超聲波破碎法超聲波破碎法是一種輔助浸取技術(shù)。超聲波的”空化作用”產(chǎn)生極大的壓力造成被粉碎物細(xì)胞壁或整個細(xì)胞的破碎,而且整個破碎過程在瞬間完成。超聲波產(chǎn)生的振動作用增加了溶劑的湍流強度及相接觸面積,加快了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散及溶解,從而強化了傳質(zhì),有利于細(xì)胞內(nèi)有效成分的提取(3) 熱變性法熱變性法是依據(jù)SOD 的熱穩(wěn)定性原理設(shè)計的。SOD 的熱穩(wěn)定性高,當(dāng)溫度低于60 時,短時間的熱處理不會使酶活力有明顯的變化,而一般的雜蛋白卻在溫度高于55 時就易變性沉淀,因此,對大蒜粗提液進行短

24、時間的熱處理能夠達到去除雜蛋白的目的。(4) 有機溶劑分級沉淀法丙酮沉淀法利用向蛋白質(zhì)溶液中加入弱極性的有機溶劑,改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù),使不同種類蛋白質(zhì)的溶解度產(chǎn)生不同程度降低的原理可進行蛋白質(zhì)的純化。在粗酶液中逐量加入丙酮,可使SOD及其它雜蛋白的溶解度發(fā)生變化,依次從溶液中沉淀出來。氯仿- 乙醇沉淀法氯仿- 乙醇混合液可作為萃取劑將SOD 溶解于其中,并將雜蛋白沉淀出來。另外,Cu/Zn- SOD 對氯仿- 乙醇的作用不敏感,處理12 h 后,活性沒有明顯的變化,因此用該法粗分離大蒜SOD 是可行的。(5) 硫酸銨分級鹽析法鹽析法是利用在高濃度的電解質(zhì)溶液內(nèi),蛋白質(zhì)分子表面的水化層被破壞,使

25、蛋白質(zhì)分子中的憎水區(qū)域裸露而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集沉淀的原理進行分離的。硫酸銨因價廉、溶解度大,且能使蛋白質(zhì)的性質(zhì)保持穩(wěn)定而成為最常見的鹽析劑。(6) 透析透析是利用蛋白質(zhì)分子不能經(jīng)過半透膜,而使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)分開的方法。透析一般不作為純化酶的一種單元操作,但經(jīng)過透析可除去酶液中的鹽類、有機溶劑、低分子量抑制劑等,因此它在純化過程中極為常見。透析膜的截留極限一般在分子量5 000 左右,而Cu/Zn- SOD的分子量遠(yuǎn)高于此,因此適合于透析法。(7) 膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)采用了能選擇地透過一種物質(zhì),而阻礙另一種物質(zhì)透過的具有特定性質(zhì)的半透膜,它的實質(zhì)是利用物質(zhì)經(jīng)過膜的傳遞速度不同而使其得以

26、分離。1.3 SOD的檢測我們經(jīng)過測定SOD的酶活性,檢測SOD。氧化物歧化酶(SOD)的催化底物是O2 ,一般多以一定時間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物的消耗量作為酶活性單位。由于O2 自身很不穩(wěn)定,且不易制備,測定SOD的方法除少數(shù)采用直接法外,一般多為間接法。常見的有: 鄰苯三酚自氧化法即改良Marklund法。原理是基于經(jīng)典的分光光度法,在堿性條件下,鄰苯三酚自氧化成紅桔酚,用紫外-可見光譜跟蹤波長為325nm、420nm或650nm(經(jīng)典為420nm),同時產(chǎn)生O2 ,SOD催化O2 發(fā)生歧化反應(yīng)從而抑制鄰苯三酚的自氧化,樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率,可反映樣品中的SOD含量。本法具有特異性

27、強,所需樣本量少(僅50l),操作快速簡單,重復(fù)性好,靈敏度高,試劑簡單等優(yōu)點。 細(xì)胞色素C還原法(McCord法)原理是黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的O2 使一定量的氧化型細(xì)胞色素C還原為還原型細(xì)胞色素C,后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在時,由于一部分O2 被SOD催化而歧化,O2 還原細(xì)胞色素C的反應(yīng)速度則相應(yīng)減少,即其反應(yīng)受到抑制。將抑制反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)與SOD濃度作圖可得到抑制曲線,由此計算樣品中SOD活性。本法是間接法中的經(jīng)典方法,但本法靈敏度較低。(3)化學(xué)發(fā)光法原理黃嘌呤氧化酶在有氧條件下,催化底物黃嘌呤或次黃嘌呤發(fā)生氧化反應(yīng)生成尿酸,同時產(chǎn)生O2。后者可與化學(xué)發(fā)光劑魯米

28、諾反應(yīng),使其產(chǎn)生激發(fā)。SOD能清除O2 從而抑制魯米諾的化學(xué)發(fā)光。本法可應(yīng)用于SOD的微量測定,不但靈敏度高,簡便易行,而且特異性與準(zhǔn)確性至少與細(xì)胞色素C還原法類似。(4)電泳法電泳染色定位法的基本原理是根據(jù)光化學(xué)法與NBT還原法。電泳則采取垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳。既可采用SOD活性正染色(呈現(xiàn)棕色區(qū)帶)也可采取SOD活性負(fù)染色(呈現(xiàn)無色透明區(qū)帶)。根據(jù)凝膠上電泳分離的SOD區(qū)帶的著色深淺與面積大小,對樣品進行半定量分析,也可制作校正曲線計算樣品中的SOD含量。染色定位法常見于鑒定SOD,很少為了定量,主要原因是它不及化學(xué)法簡便,但鑒定SOD卻較化學(xué)法為優(yōu)。用電泳法可鑒定SOD是否摻有雜質(zhì)蛋

29、白,有無同工酶,且可半定量地確定SOD的活性大小。2.方案制定2.1 SOD的制備(1)實驗原理SOD廣泛存在于各種生物體內(nèi),迄今為止人們已從各種動物臟器、血液、原生動物、植物、昆蟲、藻類、細(xì)菌、真菌等各種生物組織中成功分離得到了SOD。我們這次利用大蒜制取SOD。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有豐富的SOD,經(jīng)過組織或細(xì)胞破碎后,用pH7.8的磷酸緩沖液提取出來。再用氯仿-乙醇混合液去除雜蛋白,再用鹽析法和有機溶劑法兩種方法分離出SOD沉淀。(2)實驗原料、試劑、器材與儀器實驗原料:大蒜蒜瓣實驗試劑:石英砂、磷酸緩沖液(0.05mol/L,pH7.8)、氯仿-乙醇混合液、固體硫酸銨、連苯三

30、酚、K2HPO4-KH2PO4緩沖液器材與儀器:離心機、紫外分光光度計、研缽、離心管、玻璃棒、托盤天平等(3)操作步驟整個過程在0-5條件下進行SOD酶的提取:稱取5克大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎細(xì)胞后,加入pH7.8、0.05mol/L的磷酸緩沖液15ml,繼續(xù)研磨20min,使SOD酶充分溶解到緩沖溶液中,然后6000rpm冷凍離心15min,棄沉淀,取上清液。去除雜蛋白:上清液中加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min,6000rpm離心15min,棄去沉淀,得到的上清液即為粗酶液。SOD的沉淀分離:粗酶液在攪拌下緩慢加入固體硫酸銨至飽和濃度60,持續(xù)攪拌15min,6000r

31、pm離心15min,得到SOD酶沉淀。SOD的純化:將沉淀溶于pH7.8、0.05mol/L的5ml緩沖液中,然后6000rpm冷凍離心15min,棄沉淀,取上清液,用凝膠Sephacryl S-200進行純化,然后超濾濃縮。將濃縮液冷凍干燥后即得成品2.2 SOD的檢驗(1)檢驗原理連苯三酚在堿性條件下,能迅速自氧化,釋放出O,生成帶色的中間產(chǎn)物。在自氧化過程的初始階段,黃色中間物的積累在滯后3045s后就與時間成線性關(guān)系。在有SOD存在時由于它能催化O生成O2與H2O2,從而阻止了中間物的積累,經(jīng)過計算就能求出SOD的活力。連苯二酚自氧化法測定酶活力,酶活力按下式計算:總活力(U)= 單位

32、體積活力原液總體積比活力(U/mg)=單位體積酶液活力/單位體積酶活力單位定義:在25恒溫條件下,每毫升反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。(2)檢驗所需溶液的配制pH8.3的0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液:25下96.5ml的1mol/L K2HPO4與3.5ml 的1mol/L的KH2PO4混合后,用水稀釋至 ml0.05mol/L連苯三酚溶液:稱取3.15g連苯三酚用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定容至500ml(3)檢驗步驟(即酶活力的測定)測定連苯三酚的自氧化速率,調(diào)節(jié)連苯三酚溶液用量,將其自氧化率控制在0.070(0.002

33、)D/min,經(jīng)試驗測得連苯三酚溶液用量為6l樣品活性的測定 在10ml試管中加入pH8.30的4.50ml的K2HPO4-KH2PO4緩沖液和一定體積的樣液,在250.5的恒溫水浴中保溫10min,然后加入在250.5的恒溫水浴中預(yù)熱好的連苯三酚溶液6l,空白管用0.01mol/L的HCl代替,迅速搖勻倒入1cm比色杯中,以空白管為參比,在325nm下,每隔30s測一次吸光值,連續(xù)記錄3min,調(diào)節(jié)樣液體積,使樣液中連苯三酚的氧化速度控制在0.035(0.002)D/min,記錄此時樣液體積。3.PPT展示1.查找資料1.1卵磷脂基礎(chǔ)知識1.1.1基本介紹卵磷脂屬于一種混合物,是存在于動植物

34、組織以及卵黃之中的一組黃褐色的油脂性物質(zhì),卵磷脂是生物膜的重要組分,其構(gòu)成成分包括磷酸、膽堿、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯以及磷脂。卵磷脂被譽為與蛋白質(zhì)、維生素并列的”第三營養(yǎng)素”。 化學(xué)名稱:磷脂酰膽堿,簡稱:PC ,卵磷脂按照其純度的高低,一般分為 PC50、PC 60 、PC70、PC80、PC 90、PC95等產(chǎn)品形式。最高能夠提純到98%,因為其純度越高,氧化性能越強,越不易保存,故提純到98%的卵磷脂需要做氫化處理,然后保存。未經(jīng)過氫化處理的卵磷脂,一般要求在充氮的密封容器中。純凈的卵磷脂常溫下為一種無色無味的白色固體,由于制取或精制方法、儲存條件不同被氧化而呈現(xiàn)淡黃色至棕色。磷

35、脂最早是由Uauquelin于18 從人腦中發(fā)現(xiàn),Golbley于1844年從蛋黃中分離出來,并于1850年按照希臘文lekithos(蛋黃)命名為Lecithin(卵磷脂),因此又稱為蛋黃素,并以希臘文命名為Lecithos(卵磷脂)。1.1.2主要來源蛋黃中含有豐富的卵磷脂,牛奶、動物的腦、骨髓、心臟、肺臟、肝臟、腎臟以及大豆和酵母中都含有卵磷脂。其中又以屬蛋黃、大豆和動物肝臟的含量最高,雞蛋中的卵磷脂品質(zhì)最高,可是難以提取,這使得其價格堪與黃金相媲美。1.1.3功效(1)人體營養(yǎng)需要人體所需的外源性膽堿90%是由卵磷脂提供,當(dāng)膳食膽堿不足時,體內(nèi)尚存卵磷脂的內(nèi)源資源即也可補充人體需要(2

36、)對血清脂質(zhì)的調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)血清脂質(zhì)水平意味著能降低膽固醇水平,保護肝臟,也能改進記憶力,加強免疫力以及抗脂肪肝的活力。(3)有助于胞囊纖維變性時對脂肪的吸收胞囊纖維變性是一種外分泌腺失調(diào),一般都是因為體內(nèi)脂質(zhì)有限,胰脂酶,膽汁鹽和碳酸氫鈉存量不足引起。胞囊纖維變性嚴(yán)重影響脂肪的吸收,攝入脂肪有30%-60%吸收不良,因而會造成脂肪痢。溶血磷脂酰膽堿能使攝入脂肪移位,將甘油一酯及脂肪酸在低共熔基質(zhì)中相結(jié)合。在有碳酸氫鈉離子及膽汁鹽情況下,變得容易吸收。(4)健康心臟證實卵磷脂對心臟健康有積極作用,因為它能調(diào)節(jié)膽固醇在人體內(nèi)的含量、有效降低膽固醇、高血脂及冠心病的發(fā)病率。(5)有益大腦,增強記憶力

37、,延緩衰老腦神經(jīng)細(xì)胞中卵磷脂的含量約占其質(zhì)量的17%-20%。卵磷脂的充分供應(yīng)保證充分的”膽堿”與人體內(nèi)的”乙?！焙铣蔀椤币阴Ｄ憠A”,”乙酰膽堿”是大腦內(nèi)的一種信息傳導(dǎo)物質(zhì),腦部的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)(乙酰膽堿)減少是引起老年癡呆的主要原因,補充卵磷脂能提高腦細(xì)胞的活性化程度,提高記憶與智力水平。長期補充卵磷脂能夠減緩記憶力衰退的進程,預(yù)防或推遲老年癡呆的發(fā)生。(6)滋潤皮膚卵磷脂是人體每一個細(xì)胞不可缺少的物質(zhì),如果缺乏,就會降低皮膚細(xì)胞的再生能力。卵磷脂是一種天然的解毒劑,它能分解體內(nèi)過多的毒素,并經(jīng)肝臟和腎臟的處理排出體外,正常人體內(nèi)含有許多毒素,特別是在腸道內(nèi),當(dāng)這些毒素含量過高時,便會隨著血液

38、循環(huán)沉積在皮膚上,從而形成色斑或青春痘。再加上卵磷脂良好的親水性和親油性,缺乏會導(dǎo)致皮膚粗糙、有皺紋。另外,卵磷脂所含的肌醇還是毛發(fā)的主要營養(yǎng)物,能抑制脫發(fā),使白發(fā)慢慢變黑。(7)調(diào)劑心理社會競爭日趨激烈,人們長期處在緊張的環(huán)境和種種壓力下,常患有焦慮、急躁、易怒、失眠、耳鳴等癥,即植物神經(jīng)紊亂,一般被稱為神經(jīng)衰弱。經(jīng)常補充卵磷脂,可使大腦神經(jīng)及時得到營養(yǎng)補充,保持健康的工作狀態(tài),利于消除疲勞,激化腦細(xì)胞,改進因神經(jīng)緊張而引起的急躁、易怒、失眠等癥。另外,吸煙的人應(yīng)該多多的補充卵磷脂。1.1.4應(yīng)用因為有這些生物學(xué)功能,常有以下的應(yīng)用(1)保護肝臟(2)健康心臟(3)促進大腦發(fā)育,增強記憶力,

39、預(yù)防老年癡呆癥(4) 血管的”清道夫”(5)糖尿病患者的營養(yǎng)品(卵磷脂不足會使胰臟機能下降,無法分泌充分的胰島素,不能有效地將血液中的葡萄糖運送到細(xì)胞中,這是導(dǎo)致糖尿病的基本原因之一。)(6)有效地化解膽結(jié)石(體內(nèi)過多的膽固醇會發(fā)生沉淀,從而形成膽結(jié)石,膽結(jié)石90%是由膽固醇組成。)(7) 胎、嬰兒神經(jīng)發(fā)育的必須品(人體腦細(xì)胞約有150億個,其中70%早在母體中形成。嬰幼兒時期是大腦形成發(fā)育最關(guān)鍵時期,卵磷脂能夠促進大腦神經(jīng)系統(tǒng)與腦容積的增長、發(fā)育。為了促進胎兒腦細(xì)胞能健康發(fā)育,孕婦補充分夠的卵磷脂是很重要的。)(8)消除青春痘、雀斑并滋潤皮膚(9)卵磷脂能夠促進腸胃血液循環(huán)及腸胃蠕動,有助于

40、預(yù)防及改進便秘(10)良好的心理調(diào)和劑因此它的適用人群是:嬰幼兒,學(xué)生、知識分子及中老年人,長期飲酒、營養(yǎng)過剩及脂肪肝患者,、糖尿病患者,膽結(jié)石患者,愛美的女士,便秘人群。當(dāng)前市場上的卵磷脂多是從大豆中提取,工業(yè)用卵磷脂的劑型主要有:液體、顆粒、粉末三種,液體濃度在70%左右,顆粒及粉末可達95%以上。卵磷脂軟膠囊是以液體卵磷脂為原料加入甘油或大豆油稀釋后,用明膠包裹而成,有效成分含量低一般少于60%,價格較低,是大部分品牌卵磷脂采用的劑型。1.2卵磷脂的制備當(dāng)前,國際上制備卵磷脂的方法主要有有機溶劑萃取法、柱層析法、半透膜分離法、乙?；ā⒅苽浔由V法、高效液相色譜法、超臨界CO2萃取法。

41、可是對于蛋黃卵磷脂來說,其提取純化方法研究還比較有限,主要有以下幾種:(1)有機溶劑提取法有機溶劑法最為常見,原理是蛋黃中各組分以及不同的磷脂組分在有機溶劑中的溶解度不同。溶劑提取法的關(guān)鍵在于找到一種好的溶劑或溶劑系統(tǒng),對被提取的目標(biāo)產(chǎn)物應(yīng)具有良好的溶解性和選擇性。其優(yōu)點是分離效率高、生產(chǎn)周期短、易實現(xiàn)自動化;缺點是卵磷脂純度不高,處理時間長,且存在有機溶劑殘留的問題。蛋黃中的油脂、中性脂肪以及游離脂肪酸可由丙酮脫除,不溶于丙酮的磷脂沉淀,再使用低碳醇、正己烷、乙醚等溶劑將溶于其中的卵磷脂與不溶于這些溶劑的其它磷脂分離開來。也可先浸提卵磷脂再脫油。但有國外的研究表明,先用丙酮對蛋黃進行脫油會降

42、低PC的得率,這是因為有一部分PC溶解在丙酮中損失掉了。(2)超臨界萃取法超臨界CO2 萃取法簡單、無溶劑殘留、選擇性強,是近年來在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域迅速發(fā)展起來的新技術(shù)。高進等用此法分離蛋黃粉中的蛋黃油,優(yōu)化出最佳提取條件為:萃取壓力30MPa, 萃取溫度50, 萃取時間150min, 流量20L /h,再向CO2 流體中加入夾帶劑乙醇萃取脫油磷脂中的卵磷脂,萃取率最高達8219%。但相對于直接采用乙醇浸提法來說,超臨界CO2 夾帶乙醇萃取蛋黃卵磷脂溶劑用量大,耗時,操作成本高,不易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。(3)酶催化精制提取法卵黃卵磷脂中除含有磷脂酰膽堿外還含有磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酸等磷脂

43、,而采用磷脂酶可將這些磷脂轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿,這樣可大大提高磷脂酰膽堿含量,提高其有效成分純度,或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化成其它可利用的磷脂。Lekh 等人(1989 年) 采用酶法來提高卵磷脂中磷脂酰膽堿的含量,所采用的酶為來源于卷心菜中的磷脂酶,其研究結(jié)果可將含磷脂酰膽堿為80 %的大豆卵磷脂和含磷脂酰膽堿為75 %的卵黃卵磷脂的磷脂酰膽堿含量分別提高為95 %和100 %。(4)色譜精制提取法采用色譜提取高純度物質(zhì)是一種極具潛力的提取方法。Jorn (1980 年) 采用色譜法生產(chǎn)出以鮮雞蛋為原料的高純度卵磷脂產(chǎn)品,其以Al2O3 為固定相,二氯甲烷925 mL 加甲醇70 mL 加25 %液態(tài)氨5 mL

44、 為流動相,流速為8 mL/ min , 產(chǎn)品純度可達化學(xué)純標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)亦有相關(guān)研究出現(xiàn),提出了以硅膠為固定相、甲醇和水(體積比982) 為流動相或離子纖維素為固定相、二氯甲烷和甲醇(體積比9 1) 為流動相,生產(chǎn)純度為98 %以上的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺及溶血磷脂酰膽堿。1.3卵磷脂的檢測卵磷脂的測定方法主要有薄層掃描法、高效液相色譜法、紫外可見分光光度法、熒光光度法,另外還有檢測水解產(chǎn)物。對于蛋黃卵磷脂來說,當(dāng)前高效液相法(HPLC)較為普遍。這里重要介紹檢測水解產(chǎn)物和薄層層析法(1)檢測水解產(chǎn)物法檢測原理:卵磷脂可在堿性溶液中加熱水解,得到甘油、脂肪酸、膦酸和膽酸。檢測步驟:水解:在卵磷

45、脂中加入20%氫氧化鈉溶液并在沸水浴中水解,冷卻過濾,得到白色沉淀。脂肪酸的檢測:沉淀中加入水,并加入硝酸后用膠頭滴管加入兩滴10%醋酸鉛,觀察清液變渾濁,液體中有絮狀物出現(xiàn)甘油的檢測:取一支試管,加入1%CuSO4 1滴于試管中,滴加2滴20%NaOH溶液,振搖,溶液呈藍(lán)色,有些許絮狀物,加入1mL水解液,振搖,溶液稍許渾濁,顏色變深。膽堿的檢查:加入1mL水解液于試管中,滴加硫酸酸化,以pH試紙試之,加入1滴碘化鉍鉀溶液,觀察得溶液呈淡黃色且有絮狀物。(2)薄層層析法含義:薄層層析是將吸附劑或者支持劑(有時加入固化劑)均勻地鋪在一塊玻璃上,形成薄層。把欲分離的樣品點在薄層上,然后用適宜的溶

46、劑展開,使混合物得以分離的方法。由于層析在薄層上進行故而得名?；驹?薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法,它利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同,使在移動相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中,連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,從而達到各成分的互相分離的目的。根據(jù)樣品比移值(Rf)與標(biāo)準(zhǔn)品按同法所得的色譜圖的比移值(Rf)作對比,用以進行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。檢測步驟:制板稱取20 g 孔徑為6 nm 的硅膠60, 用45mL 1- 1molL 的碳酸鈉溶液稀釋, 置于研缽中研磨, 調(diào)成均勻的糊狀物, 涂布器將糊狀物均勻地鋪在玻璃板上, 鋪完后于室溫下風(fēng)干, 使用前在110

47、烘箱中活化。點樣用毛細(xì)管在層析板距下端2. 5 cm 處點兩個樣,自制卵磷脂樣品和標(biāo)準(zhǔn)品, 樣點的間距為3 cm。展開 將展開劑置于層析缸中平衡30m in, 使溶劑的蒸汽壓在層析缸中達到平衡, 然后放入層析板, 溶液自下而上在層析板上展開, 上升速度約6 cm/h 當(dāng)展開到層析板高度的3/4 處即可取出, 置室溫下干燥。顯色將顯色劑均勻地噴霧在層析板上, 可立即看到有藍(lán)色斑點出現(xiàn)2.方案制定經(jīng)過考慮實驗的實際可行性,和成本,我們采用有機溶劑法(1)實驗原理有機溶劑法是根據(jù)蛋黃中各組分在溶劑中的溶解度不同而進行分離的。室溫下,取10mL新鮮蛋黃用兩倍體積的乙醇進行提取,混合攪拌,離心(3000

48、r/min)5min,將沉淀物重復(fù)抽提幾次后,取上清液,60蒸餾至近干,加入丙酮,分離沉淀物,真空干燥30min,得到淡黃色粗制卵磷脂,稱重.(2)實驗流程熟雞蛋蛋黃 加乙醇研磨(乙醇萃取) 抽濾 將過濾液移入蒸發(fā)皿 蒸發(fā) 黃色油狀物 加氯仿溶解油狀物 加丙酮攪拌 離心 成品(3)操作步驟(1)取新鮮雞蛋一只,除去蛋清取其蛋黃,加入20ml95%乙醇混合攪拌,4000rpm,離心10min,回收上清液,將沉淀物重復(fù)提取三次,抽濾回收上清液,合并二次濾液(2)濾液進行減壓蒸餾至近干,得到黃色油狀物,用石油醚洗下油狀物,加丙酮分離沉淀物,及粗卵磷脂(3)按20g卵磷脂:250ml無水乙醇,溶解粗卵

49、磷脂,滴加60%ZnCl2沉淀卵磷脂,直至不產(chǎn)生沉淀,抽濾(4)加10ml左右冰丙酮洗滌攪拌,至丙酮溶液為近無色,抽濾得到白色蠟狀精制卵磷脂3.PPT展示1.資料查找1 .1香菇多糖相關(guān)知識與市場價值香菇多糖是從香菇中提取的一種多糖,它的結(jié)構(gòu)主要以-D-13葡萄糖殘基為主鏈,側(cè)鏈為(16)葡萄糖殘基的葡聚糖。香菇多糖為白色粉末狀固體,對光和熱穩(wěn)定;水中最大溶解度為3mg/ml,能溶于0.5mol/ml的NaOH,溶解度可達50100mg/ml。不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑中。香菇多糖具有吸水性,因此要注意密封保存。在組織中,多糖多與蛋白質(zhì)以共價鍵結(jié)合。人們對多糖的認(rèn)識首先是多糖是食物中的能

50、量來源,但經(jīng)過近幾十年的研究,人們發(fā)現(xiàn)多糖類在生物體中不但作為能量資源和結(jié)構(gòu)材料,更重要的是它參與細(xì)胞中的各種活動,具有各種各樣的生物學(xué)功能,這就是多糖中特殊重要的一類活性多糖。活性多糖因有抗腫瘤增強免疫力降血糖抗?jié)兊壬锘钚?越來越引起人們的關(guān)注。一般來說,真菌多糖具有較高的抗腫瘤活性,香菇多糖就是其中一種,除了抗腫瘤性,香菇多糖還有抗放射性護肝解毒的功能,是一種天然抗腫瘤藥,而且它的毒副作用與一般的化療藥物相比,輕微得能夠忽略不計,但由于環(huán)境的影響產(chǎn)量低,制備困難,成本高,純度低,價格昂貴,當(dāng)前只有美國才能提取高純度治療腫瘤的香菇多糖,國內(nèi)只能依賴進口,普通人難以消費。1.2制備方法當(dāng)前

51、,香菇多糖的制取方法主要有熱水浸提法、稀酸(堿)浸提法、酶解法、微波提取法、超聲波提取法、深層發(fā)酵提取法,另外幾種提取方法可結(jié)合使用,實際生產(chǎn)為了提高效率,降低成本,常常結(jié)合使用,如熱水浸提結(jié)合超聲波,復(fù)合酶解法結(jié)合微波提取去,深層發(fā)酵結(jié)合稀酸稀堿法,還有超臨界CO2輔助提取法,這也是將超臨界CO2萃取脫脂和熱水提取法結(jié)合的一種方法無論何種提取法,其主要步驟基本相同:預(yù)處理(粉碎香菇)浸提(使多糖與細(xì)胞分離)過濾(得到多糖溶液)濃縮醇析(得到粗多糖)純化(脫色,除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì))1.2.1 熱水浸提法(1) 操作步驟預(yù)處理取適量香菇,洗干凈,搗碎提取將搗碎的香菇放入搪瓷缸里,加適量水煮沸,浸漬

52、一段時間,過濾,收集濾液濃縮將濾液濃縮至適當(dāng)體積醇析在濃縮液中加入乙醇,靜置,得到多糖沉淀除去蛋白質(zhì)將沉淀溶于0.5mol/L的NaOH溶液中,加入氯仿,沉淀蛋白質(zhì)成品將上一步的上清液蒸發(fā)干燥得到香菇多糖(2)實驗影響因素?zé)崴釙r,料液比、溫度、時間、pH值,醇析時的乙醇添加倍數(shù)及提取次數(shù)是影響多糖得率的主要因素。對料液比而言,若加水太少,提取不徹底;加水太多,容易降低提取物的固形物含量,不利于以后的分離。對溫度而言,隨著提取溫度的升高,粗多糖得率升高,在80-95時達到高峰,再提高溫度,粗多糖得率升高趨勢趨于平緩,高溫也會破壞多糖的結(jié)構(gòu)熱水浸提時的pH值為自然pH值,大約在6-8之間。而對

53、醇析時提取液的乙醇濃度來說,隨著其逐漸升高,多糖得率也逐漸增加,但乙醇濃度達到75%后再繼續(xù)添加乙醇,對粗多糖得率影響不大提取次數(shù)對多糖得率也有一定的影響,多糖得率隨著提取次數(shù)的增加而增加,但次數(shù)過多多糖得率增加緩慢,趨于平緩,一般適宜的提取次數(shù)是兩次。1.2.2 稀酸(堿)提取法這種提取法操作步驟和熱水提取法相同,只不過提取劑是酸或堿。一般情況下,0.4mol/L的HCl溶液在40-60范圍內(nèi),多糖得率較高,需注意,香菇多糖提取應(yīng)避免在強酸、強堿環(huán)境下進行,否則極易造成香菇多糖中糖苷鍵的斷裂及構(gòu)象變化而形成較多單糖,影響多糖得率,因此較少采取此法提取。對提取的影響因素和熱水提取法相同1.2.

54、3 酶解法酶解法就是在浸提過程中加入相應(yīng)的酶來水解纖維素、果膠、蛋白質(zhì)分子等,以使多糖從細(xì)胞中分離出來。一般情況下,復(fù)合酶的提取效果要明顯高于單酶的提取,香菇細(xì)胞壁很堅固,多種酶共同作用于香菇的細(xì)胞壁,使其破裂,多糖易于從細(xì)胞內(nèi)釋放,比單一酶提高了多糖得率。這種方法的操作步驟跟熱水提取法也相同,只不過提取劑換成了酶。酶提取時,影響因素主要有:酶用量,酶作用時間,溫度,pH,酶用量要足,時間要充分,溫度和pH要適宜,具體數(shù)據(jù)要跟據(jù)酶種類來定。1.2.4 微波法提取香菇多糖(1) 微波提取法簡介微波提取法是一種新型提取法,主要利用微波的加熱效應(yīng)和生物破壁效應(yīng),由于溶劑及細(xì)胞液吸收微波能,細(xì)胞內(nèi)部溫度升高壓力增大,當(dāng)壓力超過細(xì)胞的承受能力時,細(xì)胞壁破裂,位于細(xì)胞內(nèi)部的多糖就從細(xì)胞中釋放出來。(2) 操作步驟預(yù)處理,粉碎香菇子實體加一定量蒸餾水,放入微波爐中過濾提取液(3)實驗影響因素在微波提取多糖實驗中,影響多糖提取率的主要因素有:微波功率、提取時間、提取次數(shù)等。隨著微波功率的提高,分子運動速度加快,加速香菇多糖從外層細(xì)胞轉(zhuǎn)移到溶液中,香菇多糖得率提高,但功率過大時,多糖部分會被碳化,因此微波功率一般為700w至900w。隨著微波