艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法課件

1、HIV-1耐藥及耐藥檢測中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院艾滋病研究所張 旻 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法1HIV-1耐藥及耐藥檢測中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院艾滋病抗病毒艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法2艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法2HIV病毒模式圖HIV病毒顆粒由基因組RNA、外膜蛋白Env、衣殼蛋白Gag、逆轉(zhuǎn)錄酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN組成艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法3HIV病毒模式圖HIV病毒顆粒由基因組RNA、外膜蛋白EnvHIV生活周期吸附穿入脫殼生物合成組裝成熟和釋放艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法4HIV生活周期吸附穿入脫殼生物合成組裝成熟和釋放艾滋HIV基因組模式圖艾滋病抗病毒治

2、療的耐藥檢測方法5HIV基因組模式圖艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法5我國及國際兩種不同抗HIV治療方案效果比較治療方案國內(nèi)治療病毒抑制效果國際治療病毒抑制效果平均治療時間(月)載量9590-9580-9070-8070服藥依從性 (%)82.171.466.754.621.72.艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法24那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?病毒學失敗率 (%)02040那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?服藥依從性 (%)2.艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法25那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?服藥依從性 (%)2.艾滋病抗那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?藥物配伍不當 藥代顯著不同藥物配伍3.024483

3、612時間 (小時)藥物濃度潛在病毒復制區(qū)IC90IC50最后一次用藥 第一天第二天單藥治療S. Taylor et al. 11th CROI Abs 131艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法26那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?藥物配伍不當 藥代顯著不同藥那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? 細胞周期依賴性藥物AZT, D4T ( 活化期細胞)DDI (靜止相細胞)蛋白酶抑制劑 (活化期細胞) 非細胞周期依賴性藥物3TC, FTC, AbacavirTenofovirNNRTIs3. 藥物配伍不當 缺乏對某一時相細胞內(nèi)病毒抑制或抑制不足艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法27那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? 細

4、胞周期依賴性藥物3. 藥那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? 胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉； 隨意間歇服藥； 與中藥或其他藥物同時服用。4. 其他因素艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法28那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? 胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉什么是好治療方案? 能快速抑制病毒； 不易產(chǎn)生耐藥性； 可長期維持；艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法29什么是好治療方案? 能快速抑制病毒；艾滋病抗病毒治療的耐藥耐藥性分類1、原發(fā)性耐藥(Primary resistance): 病人在接受抗病毒治療前產(chǎn)生了藥物作用靶點的變異，或者感染了耐藥毒株，均降低抗病毒藥物的敏感性。在已經(jīng)開展HAART的國家普遍存在，感染了耐

5、藥毒株的病人很容易引起藥物治療失敗。2、繼發(fā)性耐藥(Secondary resistance): 病人已經(jīng)接受了抗病毒治療并產(chǎn)生治療失敗，在藥物的選擇壓力下產(chǎn)生的耐藥。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法30耐藥性分類1、原發(fā)性耐藥(Primary resistanc耐藥機制： 核苷和核苷類似物1、破壞核苷類似物結(jié)合病毒DNA的能力 M184V 突變: RT酶第184位密碼子 的氨基酸由蛋氨酸(M)變成為纈氨酸(V) 。拉米夫定(Lamivudine) Q151M mutation: 在HIV-1中出現(xiàn)低于 5%；HIV-2中出現(xiàn)頻率較高。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法31耐藥機制： 核苷和核苷類似

6、物艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測耐藥機制：2、切除病毒DNA鏈末端的核苷類似物Thymidine analogues mutations: 突變引起ATP或者焦磷酸介導的切除DNA鏈3末端核苷類似物。核苷和核苷類似物艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法32耐藥機制：2、切除病毒DNA鏈末端的核苷類似物核苷和核苷類似耐藥機制：非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI) 突變降低了抑制劑對酶的結(jié)合力。不同于核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其單一突變就能導致高度耐藥。如K103N、Y181C。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法33耐藥機制：非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)艾滋病抗病毒治療耐藥機制：K103N突變的機制艾滋病抗病毒治

7、療的耐藥檢測方法34耐藥機制：K103N突變的機制艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法耐藥機制：蛋白酶抑制劑 HIV蛋白酶由兩個同樣的蛋白質(zhì)鏈組成。這兩個蛋白質(zhì)鏈在一起就如同核桃的兩半，而蛋白酶的活性位點就在兩個半殼的中間。 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法35耐藥機制：蛋白酶抑制劑 HIV蛋白酶由兩個同樣的蛋白質(zhì)鏈突變點的表示方法： 基因的突變通常以字母數(shù)字字母的書寫方式來表示，第一個字母代表野生型病毒株特定密碼子處的氨基酸，第二個字母代表在特定密碼子處替換了的氨基酸，中間數(shù)字表示突變點的位置。例如：逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）K103N的突變表示逆轉(zhuǎn)錄酶第103位密碼子的氨基酸由天冬酰胺（K）變成為賴氨酸（N

8、）。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法36突變點的表示方法： 基因的突變通常以字母數(shù)字如何檢測耐藥株： 目前耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變。基因型檢測的費用較低，技術(shù)也相對容易，可在樣品收集后12周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關(guān)知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對結(jié)果進行正確的分析。表型檢測可以直接檢測病毒的耐藥性，但操作復雜、耗時，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國際上廣泛應用于臨床的是基因型耐藥檢測。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法37如何檢測耐

9、藥株： 目前耐藥性檢測有兩種方法，即表如何檢測耐藥株：Translation into linear string of amino acidsFolding into functional proteinHIV RNA表型檢測基因型檢測基因型和表型檢測艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法38如何檢測耐藥株：Translation into linea檢測中注意事項: 在病人仍在治療失敗的方案上收集樣品，可保 證耐藥株占總病毒量的20%以上； 病毒載量 1000時, 可出現(xiàn)假陰性。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法39檢測中注意事項: 在病人仍在治療失敗的方案上收集樣品，可保我國HIV耐藥性本底抽樣調(diào)查

10、結(jié)果 1)對于RT基因區(qū)共完成對21個省區(qū)共143個樣本的測序，僅有2例發(fā)現(xiàn)具有輕微耐藥（占總樣本數(shù)的1.4%） 2)對于蛋白酶基因區(qū)本次調(diào)查共完成20個省區(qū)168個樣本的分析，僅發(fā)現(xiàn)有2例樣本（占總樣本數(shù)1.21%）具有輕微耐藥。 結(jié)論：當前我國HIV耐藥性處于較低狀態(tài)，對于幾乎所有藥物敏感，我國抗HIV藥物的使用如果有計劃的開展，應當會有較好的效果，但應加強治療依從性促進工作和耐藥毒株的監(jiān)測工作。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法40我國HIV耐藥性本底抽樣調(diào)查結(jié)果 1)對于RT基因區(qū)共完成HIV基因型耐藥性檢測（序列測定法）艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法41HIV基因型耐藥性檢測（序列測定法

11、）艾滋病抗病毒治療的耐檢 測 流 程病人血漿標本HIV RNA病毒 cDNAHIV RT和PR基因片段序列測定結(jié)果解釋RNA提取逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增特定的解釋系統(tǒng)艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法42檢 測 流 程病人血漿標本HIV RNA病毒 cDNAHI標本新鮮EDTA抗凝血漿，或-80保存，避免反復凍融艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法43標本艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法43病毒RNA提?。?Qiagen公司試劑盒）裂解標本，滅活RNA酶加到離心柱中，RNA與硅膠膜結(jié)合洗兩次，去除雜質(zhì)用無RNA酶的緩沖液洗脫RNA收集RNA備用優(yōu)點：操作簡便、快速、得率高艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法44病毒RN

12、A提?。?Qiagen公司試劑盒）裂解標本，滅活RN逆轉(zhuǎn)錄 RNA cDNA 反應體系： 10XBuffer 1l dNTP 0.5l 外側(cè)反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l42水浴1小時，95 5分鐘滅活RT艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法45逆轉(zhuǎn)錄 RNA cDNA 反應體系：艾滋病抗病毒治巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因第一輪擴增反應體系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 外側(cè)正向引物 1l 外側(cè)反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l cDNA模板 10

13、l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循環(huán)艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法46巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因艾滋病抗病毒治療的耐藥巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因第二輪擴增反應體系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 內(nèi)側(cè)正向引物 1l 內(nèi)側(cè)反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l 第一輪擴增產(chǎn)物 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循環(huán)艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法47巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因艾滋病抗病毒治療的耐藥擴增產(chǎn)物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳艾滋病抗病毒治療

14、的耐藥檢測方法48擴增產(chǎn)物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法4擴增產(chǎn)物純化QIAquick Gel extraction試劑盒核酸序列測定雙脫氧鏈末端終止法艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法49擴增產(chǎn)物純化艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法49:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAA

15、AGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCC

16、ATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGG

17、ATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法50:艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法50利用網(wǎng)絡(luò)工具確定耐藥性突變并進行耐藥性解釋 Web站點： HIV Drug Resistance

18、 Algorithm2 HIV Drug Resistance Algorithm3 HIV Drug resistance database HIV Drug Resistance Algorithm1艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法51利用網(wǎng)絡(luò)工具確定耐藥性突變并進行耐藥性解釋 Web站點：ht高度耐藥：大于60分中度耐藥：3059分低度耐藥：1529分潛在低度耐藥：1014分敏感：09分耐藥性突變計分艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法52耐藥性突變計分艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法52HIV-1耐藥性檢測的臨床指征：（1）抗病毒治療病毒學失敗需要改變抗病毒治療方案時應進行耐藥性檢測以協(xié)助選擇有

19、效的抗病毒藥物。（2）抗病毒治療病毒載量下降不理想時可進行HIV-1的耐藥性檢測。（3）抗病毒治療失敗需要進行耐藥性檢測時，應該在病人仍在服藥時或停藥后立即（4周內(nèi)）進行檢測。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法53HIV-1耐藥性檢測的臨床指征：艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方HIV-1耐藥性檢測的臨床指征：（4）急性HIV1感染的病人進行抗病毒治療，最好進行耐藥性檢測，對于選擇合適的抗病毒藥物、取得最佳抗病毒效果很有益處。（5）對于未經(jīng)抗病毒治療的慢性HIV感染者不一定要做耐藥性檢測，但當有跡象顯示感染的是耐藥性HIV毒株時（例如感染來自于正在服用抗病毒藥物的病人），就應當進行耐藥性檢測。（6）不推

20、薦對病毒載量1000cp/ml的病人做病毒載量檢測，因為病毒水平太低很難擴增出目的基因片段 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法54HIV-1耐藥性檢測的臨床指征：艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方耐藥性檢測結(jié)果的解釋HIV-1的耐藥性不是全或無的現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性檢測結(jié)果的分析和解釋都有困難所有抗病毒治療都是聯(lián)合用藥，他們之間是相互協(xié)同的，即對一種藥物的敏感性降低并不干擾同一治療方案中其他藥物的抗病毒活性。藥物即使有耐藥性也可能有益處，因為有耐藥性突變的病毒比敏感毒株的復制適應性要差得多。血清中藥物的水平，特別是蛋白酶類藥物是高度變化的，如果能夠提高血清中蛋白酶類藥物的濃度，低水平的蛋白酶耐藥性有

21、時能夠被克服。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法55耐藥性檢測結(jié)果的解釋艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法55Nucleoside Resistance MutationsZidovudine41, 67, 70, 210, 215, 219 (TAMs)Didanosine65, 74, 75, 184Zalcitabine65, 69, 74, 184Stavudine41, 67, 70, 75, 210, 215, 219(TAMs)Lamivudine184Abacavir41, 65, 67, 70, 74, 115, 184, 210, 215, 219Multinucleoside R

22、esistanceMultiple TAMs41, 67, 70, 210, 215, 219 69 insertion complex 41, 62, 67, 69, 70, 210, 215, 219151 complex 62, 75, 77, 116, 151艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法56Nucleoside Resistance MutationNNRTI Resistance MutationsNevirapine100, 103, 106, 108, 181, 188, 190, 230Delavirdine103, 181, 230, 236Efavirenz 100, 1

23、03, 108, 188L, 190, 225, 230艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法57NNRTI Resistance MutationsNeviProtease Resistance MutationsIndinavir10, 20, 24, 46, 63, 64, 82, 84, 90Nelfinavir30, 35, 36, 46, 71, 84, 88, 90Ritonavir8, 10, 20, 33, 36, 54, 63, 71, 82, 84, 90Saquinavir10, 24, 30, 46, 48, 54, 63, 64, 71, 73, 77, 81, 84, 8

24、8, 90Amprenavir 10, 32, 46, 47, 50V, 54, 84Lopinavir/r10, 20, 24, 46, 53, 63, 71, 82, 84, 90Atazanavir48, 50L, 71, 84, 88, 90艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法58Protease Resistance MutationsIKey mutations: Nucleoside RTIM184V: high level resistance to 3TCK65R: Resistance to all nucleoside RTIs except AZT.Selected by tenofovir and other NRTIs (except AZT)Thymidine analogue mutations (TAMs): 41, 67, 70, 210, 215, 219Affect susceptibility to d4T and AZT, abacavir (with multiple TAMs)艾