蛋白純化系統(tǒng)課件

1、BioLogic DuoFlow中高壓層析系統(tǒng)層析原理與操作為什么做蛋白質(zhì)純化？原理與操作純度均一的蛋白質(zhì)才能滿足物理化學(xué)性質(zhì)研究、生物活性測定、免疫學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)分析、藥理毒理實驗的要求，以揭示生命科學(xué)的規(guī)律。研究開發(fā)、中試生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物用于診斷和治療。實驗室研究A、天然生物樣品純度均一的蛋白質(zhì)純化B、重組基因工程藥物C、蛋白質(zhì)組研究差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜測序克隆表達分離純化蛋白質(zhì)是生命科學(xué)研究的基本且必要的技術(shù)手段，也是生物制品藥物生產(chǎn)的最重要的工藝步驟！其他生物分子分離純化原理與操作其他生物大分子：DNA，多糖生物小分子：多肽和小肽，核苷酸，寡糖和單糖，多環(huán)和雜環(huán)用途：用于性質(zhì)、活性等研究需要用于

2、治療和診斷的藥物用于生物、化工或食品等輕工領(lǐng)域的生化試劑離心沉淀超濾電泳層析(Chromatography)生物分離純化技術(shù)原理與操作Model 491，RotoforNote:蛋白質(zhì)分離純化的重要問題是如何在純化過程中保持溫和的條件，從而保證在此過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性不受影響。最廣泛的蛋白質(zhì)分離純化方法 條件溫和 維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與活性層析技術(shù) Ion Exchange (IEX)離子交換電荷 可用于 層析的任何步驟，根據(jù)純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細純化Size Exclusion (SEC)分子篩（或凝膠過濾）分子大小 用于中間純化、脫鹽和緩沖液交換、最后精細純化Aff

3、inity (AC)親和生物相互作用 用于復(fù)雜樣品的最早捕獲或中間純化Hydrophobic Interaction (HIC和RP) 疏水和反相疏水相互作用- 用于中間純化，去除脂類和脂多糖Ceramic Hydroxyapatite (CHT) & Ceramic Fluoroapatite (CFT)羥基磷灰石獨特分離機理，包含離子交換和金屬螯合等,可用于 層析的任何步驟，根據(jù)純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細純化原理與操作層析的5個操作步驟裝柱并平衡上樣平衡洗脫再生上樣裝填有層析介質(zhì)的層析柱分離分離組分流出原理與操作液相層析系統(tǒng)的工作流程用Pump推動溶液各種Valve系統(tǒng)選

4、取溶液控制流向通過 Column 時不同蛋白分子與填料作用強度不同因而遷移速度不同從而分開Column 洗脫液包含的蛋白 .通過檢測器確定位置和濃度Fraction Collector收集樣品原理與操作液相層析系統(tǒng)儀器結(jié)構(gòu)DuoFlow 10/40系統(tǒng)DuoFlow 工作站電導(dǎo)檢測器MX-1 梯度混合器AVR7-3 樣品進樣閥USB Bitbus 信號轉(zhuǎn)換器液晶顯示器電腦BioFrac方形組分收集器UV 檢測器DuoFlow中高壓層析系統(tǒng)工作流程DuoFLow生物相容性100% bio-compatible所有接觸溶液的系統(tǒng)以新型塑料peek為主溶液系統(tǒng)不接觸任何金屬件，避免蛋白變性和吸附化學(xué)

5、穩(wěn)定性化學(xué)穩(wěn)定性基本特征DuoFLowF10梯度泵：20.0 ml/min at 3500psi (233 bar, 23MPa) 高壓中流速的泵頭可滿足HPLC高壓液相分析和小規(guī)模制備的要求F40梯度泵：80 ml/min at 1000psi (66bar, 6.6 MPa) 中壓高流速的泵頭可滿足大規(guī)模制備，包括中試和生產(chǎn)的要求DuoFLow特色:可更換的雙泵頭只要旋下泵頭前的4根螺絲，將另一泵頭安上即可實現(xiàn)高壓中流速和中壓高流速的切換DuoFlow可將高壓中流速和中壓高流速兩種儀器的性能通過獨特的泵頭更換技術(shù)整合在一臺儀器中。靈活多樣、功能強大的擴展配置DuoFLow特色Easy to

6、 learn Software強大的分析、管理和報告功能，通過軟件整合和控制所有硬件:Maximizer, QuadTec, 2128,BioFrac,pH Monitor, all valvesDuoFLow特色Maximizer使F10和F40梯度泵流速增加一倍，壓力不變情況下達到20 ml/min or 80 ml/min ，用于工藝優(yōu)化、中試放大四元緩沖液梯度混合，尋找最佳PH和離子強度以優(yōu)化工藝增加閥的數(shù)量，達到6低壓6高壓閥，靈活配置你的層析系統(tǒng)連接第三方檢測器DuoFLow功能組件MaximizerDuoFLow功能組件Peek材質(zhì)，良好化學(xué)穩(wěn)定性密封的甘汞電極防止電極液干涸甘汞

7、不與混沖液中的金屬離子結(jié)合，防止堵塞響應(yīng)時間提高，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確和精確PH檢測器DuoFLow功能組件檢測范圍：pH014檢測靈敏度：0.01QuadTec UV/Vis 檢測器同時四波長檢測 DNA, peptides, ProteinsDuoFLow功能組件波長范圍：190-740nm四波長同步檢測波長精確性：1nmWavelengthAbsorbing Species206 nm214 nm224 nm245 nm254 nm260 nm280 nm313 nm365 nm405 nm550 nmCarboxyl groups,ester links, amide or peptide

8、 bondsPeptide bondsPeptide bondsProteins in the presence of Trion X-100Nucleotides, Nucleotide Bases,DNA, RNANucleotides, Nucleotide Bases,DNA, RNAProteins with Aromatic amino acidsCertain Vitamins, Antibiotics with Conjugated ring systemsSome steroids, NADH, NADPH, flavoproteins, bacteriochlorophyl

9、ls with Conjugated ring systemsMyoglobin with Heme groupCytochromesDuoFLow功能組件QuadTecDuoFLow功能組件BioFrac Fraction 組分收集器Make-before-break 高壓閥 AVR7-3 高壓上樣閥AVR9-8 高壓轉(zhuǎn)換閥各種低壓閥SV5-4低壓閥，緩沖液選擇SVT3-2低壓閥，溶液選擇或轉(zhuǎn)向靈活應(yīng)用各種閥和輔助泵構(gòu)建隨意層析系統(tǒng)DuoFLow功能組件閥系統(tǒng)2xAVR7-3閥構(gòu)建逆向?qū)游鱿到y(tǒng)，用于親和層析僅需切換第二個AVR7-3閥位置即可DuoFLow閥系統(tǒng)2xAVR9-8實現(xiàn)8柱切換D

10、uoFLow閥系統(tǒng)DuoFLow閥系統(tǒng)AVR9-8輔助泵實現(xiàn)自動切換上樣DuoFLow閥系統(tǒng)：柱串聯(lián)去除血清中高豐度蛋白：IgG和HSA以用于2D電泳分析DuoFLow閥系統(tǒng)：柱串聯(lián)利用各種閥構(gòu)建級聯(lián)層析系統(tǒng)，實現(xiàn)特定目的A:樣品經(jīng)閥1 柱1 閥3 閥4 收集器B: 特定組份經(jīng)閥4 閥2Loop 柱2 閥3、4 收集器前一柱子流出的特定組份直接上第二根柱子二次分離DuoFLow閥系統(tǒng)閥系統(tǒng)： 2D-LC（Liquid Chromatography）樣品：蛇毒1D Column：Uno Q強陰離子交換柱2D Column：Hi-Pore RP 318 C18反相分析柱1D柱第11組分由閥門導(dǎo)向樣

11、品環(huán)中，繼續(xù)1D色譜分析，完畢后，自動進行2D反相柱的平衡，然后進樣（1D第11組分），進行2D反相分析。第一維色譜，UNO Q1離子交換第二維色譜，RP C18反相，第一維11管組分在第二維分成多個組分第一維第11管組分1mL經(jīng)過檢測器后沒流到收集器中，而是流到第二維色譜的進樣環(huán)中，所以以空白表示，沒標(biāo)以灰色DuoFLow3XAVR7-3實現(xiàn)三柱級聯(lián)前一柱子未結(jié)合的蛋白進入第二、三根柱子，三根柱子可以獨立洗脫第一根柱子獨立上樣、洗脫，組份經(jīng)換向閥進入第二根柱子，獨立洗脫，組份經(jīng)換向閥進入多三根柱子，獨立洗脫收集DuoFLow閥系統(tǒng)BioLogic DuoFlow Basic SystemBi

12、oLogic DuoFlow Standard SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Basic SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Standard SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 20 SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 80 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 20 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 80 System 一套組件，根據(jù)需要配置多種平臺，組件共享，資源共享DuoFLowDuoFLow軟件系統(tǒng)非常直

13、觀，易學(xué)簡單明快，4個步驟進入操作：Browser Setup Protocol Run觀察樣品情況,調(diào)節(jié)色普圖和峰高度or Go Do Something Else!2 次擊鍵進入操作:Browser Run觀察樣品情況,調(diào)節(jié)色普圖和峰高度or Go Do Something Else! DuoFLow軟件系統(tǒng)Manual ScreenDuoFLow軟件系統(tǒng)Browser Enter User and Method Name DuoFLow軟件系統(tǒng)Setup select hardwareDuoFLow軟件系統(tǒng)Protocol enter methodDuoFLow軟件系統(tǒng)Post Run

14、Options - Activity DuoFLow軟件系統(tǒng)Post Run OptionsPeak TaggingDuoFLow軟件系統(tǒng)Post Run Options TRACE COMPARE 層析圖比較 單一柱子單一程序走不同樣品單一樣品和單一程序走不同柱子同一樣品和柱子走不同程序DuoFLow軟件系統(tǒng)DuoFLow軟件系統(tǒng)DuoFLow軟件系統(tǒng)液相層析系統(tǒng)應(yīng)用層析是如何物質(zhì)實現(xiàn)分類 根據(jù)分子物理化學(xué)特性的不同而達到分離 極性：polarity (solubility, volatility) HIC, RP 離子特性：ionic characteristics (charge) IE

15、X 大小與形狀：size/mass (diffusion, sedimentation) GF 結(jié)構(gòu)特征與活性位點：shape (ligand binding, affinity) AC 這些特性的區(qū)別使不同分子在層析的固定相和流動相的分配不同而達到分離 層析技術(shù)在大分子分離純化的應(yīng)用抗體制備生產(chǎn)以及免疫學(xué)研究層析技術(shù)酶工業(yè)生產(chǎn)以及酶學(xué)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究其他研究的進行組分分離或者樣品制備等其他生物活性分子功能研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究方面一、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和蛋白質(zhì)功能研究均需要高純度的蛋白質(zhì)二、層析技術(shù)是蛋白質(zhì)純化最好的手段三、層析技術(shù)能夠滿足樣品的高純度、高活性的要求蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究策略 選擇基因表達載體構(gòu)建純化目的蛋白 蛋白質(zhì)結(jié)晶組織提取基因工程細胞表達.多維核磁共振X射線解析結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)收集 利用層析進行蛋白質(zhì)純化是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)層析技術(shù)在抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用細胞培養(yǎng)細胞去除親和捕獲精純過濾除菌層析純化層析技術(shù)是純化捕獲抗體的最佳手段層析技術(shù)在天然產(chǎn)物分離和中醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用中草藥活性組分分離的研究中草藥活性組分藥理研究中草藥活性成分與蛋白質(zhì)相互作用以及治療機理的研究 分離技術(shù)扮演中藥角色層析技術(shù)在天然產(chǎn)物分離和中醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用中草藥活性成分在生命科學(xué)中的定位 基因組 蛋白質(zhì)組次生代謝產(chǎn)物組DNARNA蛋白質(zhì)（酶