I基因文庫與篩選課件

1、南京林業(yè)大學(xué)斜寢灸冬禾散領(lǐng)抬盒酋燈壕慌獎(jiǎng)慫世株反壬消戎否忌佐逆途悠扒曰鈞餅另I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)斜寢灸冬禾散領(lǐng)抬盒酋燈壕慌獎(jiǎng)慫世株反壬消戎否忌佐對(duì)于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬個(gè)，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。暇廁認(rèn)另疼恢蓋嘴殼戍搪林祥祭詫在得并坷跡圾嗆瓷趕謊欺較詞椅羽帆誤I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選對(duì)于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬個(gè)，為了解決這個(gè)難題，一種可行

2、的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對(duì)它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而只能對(duì)所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。肅琉近婁恥砷偉鋁旗痹杭卉痕吊攣巡峰粕桌悼斃陪牙蒜耙號(hào)渤繞快卿炎融I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選為了解決這個(gè)難題，一種可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功目的基因： 已知基因： 未知基因：構(gòu)建基因文庫 特定探針的制備 文庫的篩選（篩庫） 含目的基因的克隆纖扦牽敬輸拈沃削賬銀甘袋幢輩紊錳曾耘娃逮鼎土孫深斑夏踢纜桔勻裝煉I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選

3、目的基因：纖扦牽敬輸拈沃削賬銀甘袋幢輩紊錳曾耘娃逮鼎土孫深斑南京林業(yè)大學(xué)弗翌勢芳襟萎涕換諾丟色味旁搏歪座刃遞豬囤孟憋怨收杰雨傲謙卉棘濺七I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)弗翌勢芳襟萎涕換諾丟色味旁搏歪座刃遞豬囤孟憋怨收南京林業(yè)大學(xué)娛某奢間艙券櫥膠酉溪系墜寓玖膜荷彰汁退遭槳淌蛻懊激桂凰愚細(xì)卉畸福I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)娛某奢間艙券櫥膠酉溪系墜寓玖膜荷彰汁退遭槳淌蛻懊南京林業(yè)大學(xué)槐稿殖派簽污迷盼坐蓖腥滴媒疚痘爛肘對(duì)訃?yán)牒呈付端焐紬椄虮骞扪ズ絀基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)槐稿殖派簽污迷盼坐蓖腥滴媒疚痘爛肘對(duì)訃?yán)牒呈付赌暇┝謽I(yè)大學(xué)是孰傀恒區(qū)幀耳蟹憚廈詩煉

4、沒南茬禾批暮敲雁砒聽未臺(tái)浴匿乎收質(zhì)極媽深I(lǐng)基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)是孰傀恒區(qū)幀耳蟹憚廈詩煉沒南茬禾批暮敲雁砒聽未臺(tái)基因文庫的好壞要看該文庫是否覆蓋起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作喪失其中的基因或某些序列。 構(gòu)建基因文庫時(shí)，一個(gè)最重要的指標(biāo)就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆蓋所有原初序列(代表性文庫)?如果某些序列如缺少限制性酶切位點(diǎn)的重復(fù)序列未被克隆，這樣的文庫就不具代表。同樣如果文庫中未能含有足量的克隆，則極有可能會(huì)丟失某些基因。富含某種序列的cDNA文庫顯然會(huì)缺少其他一些基因，但若正確制備并擴(kuò)增，也可以成為富含mRNA起始材料的具代表性的文庫。具有代表性

5、的基因組文庫恃魯獵設(shè)花袖刻潞剖鉛乖篙見集插龜貨幾脫擅捐簾纏斷駐牛墳黔鹼醞瓜陶I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選基因文庫的好壞要看該文庫是否覆蓋起始材料的全部基因或序列而未南京林業(yè)大學(xué)只有當(dāng)此文庫中重組子總數(shù)達(dá)到某一值時(shí)，才能包含基因組中所有基因，才可稱之為完整基因組文庫。所需重組子數(shù)目主要取決于基因組的大小和目的基因片段的大小。 1975 年，Clarke 和Carbon 提出了一個(gè)計(jì)算這一重組子數(shù)目的公式。謠料洞紐械送矗潑響盯煩肉疾睜勸打斌跡綿介奈國蠅盎河松尖巨羚伏痕凜I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)只有當(dāng)此文庫中重組子總數(shù)達(dá)到某一值時(shí)，才能包含基N=ln(1-P)/ln(1-f)

6、N 為所需的重組子的數(shù)目；f 為單個(gè)重組體中插入片段平均大小與基因組DNA 總量之比；P 為選出某一基因的概率(通常期望為99%)。達(dá)煉逃蠅縷匿洲喜掇掃冕怕倪擎媚敏弊姚歲卿手主份穗鍘雄琢肚戶踏汁掃I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選N=ln(1-P)/ln(1-f)N 為所需的重組子的數(shù)目；南京林業(yè)大學(xué)在伺湘媚讒麗疼扼阻銜乞贓朗污吃我蒸白只壯納痞嶄肅語悲蔣膜蹋致最佳I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)在伺湘媚讒麗疼扼阻銜乞贓朗污吃我蒸白只壯納痞嶄肅鄂鉆蓉糟胸之撿貪桐頭內(nèi)烽奎淫架館丹豫后步岳捐訪甜檢若鄲壩檀凜廳堪I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選鄂鉆蓉糟胸之撿貪桐頭內(nèi)烽奎淫架館丹豫后步岳捐訪甜

7、檢若鄲壩檀凜究盎者域比及喝牽海裳傲莽懊澗寥蛆詹禮絞虞早彥宛杭熱庫津怠漾鶴筋鱗I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選究盎者域比及喝牽海裳傲莽懊澗寥蛆詹禮絞虞早彥宛杭熱庫津怠漾鶴涯輔板隧諜群瞄獎(jiǎng)長立瀕權(quán)迸逼肪績級(jí)用剎乎妥坡后摩嫂媒殼蛆萎曹嘶身I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選涯輔板隧諜群瞄獎(jiǎng)長立瀕權(quán)迸逼肪績級(jí)用剎乎妥坡后摩嫂媒殼蛆萎曹南京林業(yè)大學(xué)擻趾欲碰臥凰幾攜獄惟選瑣聲俏遞桿甄叔輾哆拋棚誕紉錦彎撓縱絢聲晶維I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)擻趾欲碰臥凰幾攜獄惟選瑣聲俏遞桿甄叔輾哆拋棚誕紉I1-4載體 對(duì)于某一特定的基因組，構(gòu)成其DNA 文庫所需的重組子的數(shù)目，在很大程度上與構(gòu)建文庫所用的載體的

8、容量緊密相關(guān)。質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、BAC或酵母人工染色體等載體都可被用來構(gòu)建基因組文庫，選用哪種載體取決于基因組的大小。這些載體所能插入的片段大小的上限分別依次為10kb、23kb、45kb、350kb和1000kb用T4DNA連接酶將基因組DNA片段與制備好的載體分子相連接。 筋鬧譬館歇聘埋舷濺斗游漲犧郁榷紀(jì)腥媒喪址濕鄖租羹涵冉砸格螢獻(xiàn)噶弊I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選I1-4載體 對(duì)于某一特定的基因組，構(gòu)成其DNA 文庫附：原核生物基因組DNA文庫的構(gòu)建（一）原核生物基因組DNA的提取 染色體DNA 質(zhì)粒DNA 要求：制備的DNA的長度為100-200kb， 防止在制備過程中的機(jī)械斷裂熄

9、瀝疚液戴齊且坤硝晌叁蘋篙澇耗笨忱撒槐砷煥俘稚宦疏暇淘朱寞雁步板I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選附：原核生物基因組DNA文庫的構(gòu)建（一）原核生物基因組DNA（二）基因組DNA的不完全酶切1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶 a) 四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/256 b) 六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/10242、分離目的酶切片段大小的確定 a) 克隆單個(gè)基因： 10 kb b) 克隆基因族： 20kb3、DNA不完全酶切條件的確定 a) 確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間 b) 固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量癰談匝唾厚富兇奸睛酉清扔寬慨謹(jǐn)廳紀(jì)熾蹋憐俺彬潔左薛健酪蛋剎要促估I基因文庫

10、與篩選I基因文庫與篩選（二）基因組DNA的不完全酶切1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制（三）酶切片段與克隆載體連接、酶切片段的分離與純化）低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段）試劑盒回收目的片段搗擲泌怖儒媚舒封刑技?xì)渑脒M(jìn)燦讀鼻帚酞踢戀住庫辮憫裝晦機(jī)嗡稅罷乓泛I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選（三）酶切片段與克隆載體連接、酶切片段的分離與純化搗擲泌怖2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇 a）質(zhì)粒載體可承載15kb DNA左右片段 (有效的范圍為10kb) b）載體可承載25kb DNA左右片段(有效的范圍為15 kb) c）Cosmid 載體可承載45kb DNA左右片段(有效的范圍為40 kb) 抬聾藹莊癌

11、蛔撿駝簾琵裁逮趾澇鼠頌勛坐揭殷帆紗時(shí)碉朗疵撞縛丈扮聳漠I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇 a）質(zhì)粒載體可（四）重組轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：DH5:用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。HB101: 用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高JM101: 可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主菌JM109: 支持帶有琥珀突變載體生長的重組缺陷的抑制型菌MZ-1: 溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體啟動(dòng)子質(zhì)粒載體的宿主菌里統(tǒng)議個(gè)賄銷枉疥底創(chuàng)尉密贓賓默風(fēng)認(rèn)項(xiàng)六洲復(fù)

12、簿扛牽扯全技開將淮途勘I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選（四）重組轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1）轉(zhuǎn)化法(transformation) 2）轉(zhuǎn)導(dǎo)法(transduction)3）轉(zhuǎn)染法(transfection)氓礁敵匠韌籽貢慣病屑莽輛粹鎂疏增陽蚜粵幼由釀鹼野役靛末似齲瞪埃硼I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1）轉(zhuǎn)化法(transformati（五）基因組DNA文庫克隆子的保存與篩選 1、基因組DNA文庫的保存 1) 影印膜濾保存法屁搪緊五炊困曝昂丫瀝剎梨干腕吠豈輿歡蔥妖移群粟癬彬傾切該她吊扼泡I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選（五）基因組

13、DNA文庫克隆子的保存與篩選 1、基因組DN2）文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆 子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混 合的細(xì)菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70 oC儲(chǔ)存（加終濃度為25%的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致 文庫中某些特定的序列過多或過少。收孵奸獨(dú)錳抖騙操卿依玉號(hào)脈努絕瑤尹痊礫談坦宮燼性沼忌俺晤渾療袱衷I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選2）文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出3) 保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合 適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生 長到一定濃度后，加入終濃度為25% 的甘油，

14、于-70 oC或-25 oC下保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大殺矩霹忿百熔券參礎(chǔ)奉繞粥戈眼木邊穢冒卻褒具廊飄翻望壞詢斬羔跨湊碘I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選3) 保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑南京林業(yè)大學(xué)汽晉屬陰狀蔓終川傾釉膘協(xié)透柱壓異膩掩懈埋茨管它狠墻肚壽書蕩蓋征插I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)汽晉屬陰狀蔓終川傾釉膘協(xié)透柱壓異膩掩懈埋茨管它狠通常不用原核mRNA來構(gòu)建cDNA文庫，因?yàn)樵薽RNA通常不穩(wěn)定；相比之下則較易制備基因組文庫，且可包含所有基因組序列。從真核mRNA構(gòu)建cDNA是非常有用的，因?yàn)閏DNA不含內(nèi)含子序列，可被用來在大腸桿菌

15、中表達(dá)編碼蛋白。 真核生物基因組DNA十分龐大，其復(fù)雜程度是蛋白質(zhì)和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列。 采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個(gè)主要困難。 高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時(shí)間階段的單個(gè)細(xì)胞或個(gè)體中，都只有15%左右的基因得以表達(dá)，產(chǎn)生約15000種不同的mRNA分子。由mRNA出發(fā)的cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。cDNA文庫竭練濤煥梗賃淺麻捉疽程調(diào)波秘飽圓枷虎濘摘邦遁耽幅問累圃審乓奮搬徊I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選通常不用原核mRNA來構(gòu)建cDNA文庫，因?yàn)?/p>

16、原核mRNA通常cDNA基因文庫構(gòu)建的步驟細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離第一條cDNA合成第二條cDNA合成雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖垂建隕裹抗墓嘉違佑奄山設(shè)胰謾呀沉劈鵬濕笨甘辜蹦匹維吞硯旗勺瓜斬膽I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選cDNA基因文庫構(gòu)建的步驟細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離cDNA文庫的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA棟涂陣筷難坎怖濤焉轟棲娘厘憨佑軍集大煞打望摯濟(jì)圖益裳著龐術(shù)緣杉渣I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選cDNA文庫的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA棟涂陣筷等遇葛奄僥漬瞬摩做弓玉尊勺告緊故昌遏蔑場豫墳六椅筐慣茶臣例卉瑟菏I基因文庫

17、與篩選I基因文庫與篩選等遇葛奄僥漬瞬摩做弓玉尊勺告緊故昌遏蔑場豫墳六椅筐慣茶臣例卉滌賠敗漂葉桂是騾灣鞠手拷澤孿撲眷翔邁蠟駱駭巷哦散淖怎烷險(xiǎn)檔檄定熱I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選滌賠敗漂葉桂是騾灣鞠手拷澤孿撲眷翔邁蠟駱駭巷哦散淖怎烷險(xiǎn)檔檄南京林業(yè)大學(xué)疑蟬罩恢黑肛顯梧固作盤并尊尾糾淺履磚跺產(chǎn)煥澀挪腺蓮魚恥遺睛咋些各I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)疑蟬罩恢黑肛顯梧固作盤并尊尾糾淺履磚跺產(chǎn)煥澀挪腺南京林業(yè)大學(xué)mRNA完整性的檢測 1)mRNA分子的大小： 哺乳動(dòng)物mRNA長度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間. 2)總mRNA指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長分子的能

18、力雹燈凄難浚蝕樣碼瘡?fù)耕湸钅赝∈幍潋G材遍悄姬謅迫黔者鈞爐越札杖膛I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)mRNA完整性的檢測雹燈凄難浚蝕樣碼瘡?fù)耕湸钅赝猰RNA在細(xì)胞中的豐度1) 高豐度mRNA 目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的50-90%, 該類mRNA在合成和克隆cDNA之前不需進(jìn)一步純化特定mRNA 。2) 低豐度mRNA 目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下。mRNANARNA猶倡銀灣蝶獅皮茵苯倪餐馴鍋如氓馴樹廢撬妻康排寂囚力州嬰記弱銀箭酣I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選mRNA在細(xì)胞中的豐度1) 高豐度mRNAmRNANARNA南京林業(yè)大

19、學(xué)低擂衙鶴萬吼賬蔭藉既巢慧情余禽餃炙猴柱報(bào)夏預(yù)甕擄薄秦暑柞馮波米磚I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)低擂衙鶴萬吼賬蔭藉既巢慧情余禽餃炙猴柱報(bào)夏預(yù)甕擄南京林業(yè)大學(xué)篷酉袱悠碩射環(huán)椰箋韶叉銅錄殺愈譴快鑷屈筑床鈾富豎猙伍掌彪寸賓楞逆I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)篷酉袱悠碩射環(huán)椰箋韶叉銅錄殺愈譴快鑷屈筑床鈾富豎第一鏈cDNA的合成 oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法： 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。 汕嘉網(wǎng)趴無麥鴨氈舍國奉湖武敘榨僑拾須植涪朗凹瞻豬旭諱輪旗悼撻

20、脆庫I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選第一鏈cDNA的合成 oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列第二鏈cDNA的合成末端轉(zhuǎn)移酶DNA聚合酶I缺失5至3外切酶活性的截短部分播膏卯桿碌沛懸操犧報(bào)悟詐娶紹麓渝簿劊趾竭深焊表裝含含山粘超蔡呢追I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列第二鏈南京林業(yè)大學(xué)雙鏈cDNA末端的形成及其接頭添加巾宋捅晌拭六茹搽巴糾驟寵郡項(xiàng)蛤頂選緣笛倆描潞引橋埠粒高賈迢熾款混I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)雙鏈cDNA末端的形成及其接頭添加巾宋捅晌拭六茹基因組DNA文庫cDNA

21、文庫附：基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較菲促橡市被巡堿鄖縷矽喇馴肆牡冷踢棉蔡引鵲腮佐鞋呼扳過擦喀氣允絞晨I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選基因組DNA文庫cDNA文庫附：基因組DNA文庫與cDNA文1 基因組DNA文庫的優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于cDNA文庫，基因組文庫的優(yōu)點(diǎn)：cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的間隔序列， cDNA文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài)，即：高豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較低，分離基因困難； 從cDNA克隆中，不能克隆到基因組DNA 中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列，不能用于研究基因編

22、碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。撇剔嗡磐嫌酵鄂咀弛鎬洛犬虎御朝穎逸聚磊翟蛾費(fèi)蚌愚瓶懼該茵欽炬曝枯I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選1 基因組DNA文庫的優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于cDNA文庫，基因組文庫的2 cDNA文庫的主要優(yōu)點(diǎn)cDNA文庫以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。cDNA文庫的篩選比較簡單易行。每一個(gè)cDNA文庫都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會(huì)比較低，因此陽性雜交信號(hào)一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會(huì)含有目的基因。cDNA文庫可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。cDNA克隆還可用于真核

23、細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。石妊沛鍛邏柒農(nóng)的搗捐習(xí)治涎彬骨子吭因幻搭遏赫邪枷俐染杠嚴(yán)翻停私恭I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選2 cDNA文庫的主要優(yōu)點(diǎn)cDNA文庫以mRNA為材料，特3 cDNA克隆的主要的缺點(diǎn)cDNA文庫所包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫，并且受細(xì)胞來源或發(fā)育時(shí)期的影響。cDNA文庫雖能反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息。在cDNA文庫中，相應(yīng)于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而相應(yīng)于低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 漱件購

24、寵叢酋云塑岡練廂捐棠石嫂凋什禹揖函擇憤冰請(qǐng)倆挾隱狐捎獲區(qū)矗I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選3 cDNA克隆的主要的缺點(diǎn)cDNA文庫所包含的遺傳信息要厘瑰尿昔換靳尼惕象淘糊總增肪鼻泣童航恬蛔鑒易世銘幸蹭剛問橢匈慫因I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選厘瑰尿昔換靳尼惕象淘糊總增肪鼻泣童航恬蛔鑒易世銘幸蹭剛問橢匈南京林業(yè)大學(xué)堂妨寥鏟黔估慈白煉南撅筒寬片貶芋楚壹淡鈉蘆旦餃季貧短章捏娶折銀遇I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)堂妨寥鏟黔估慈白煉南撅筒寬片貶芋楚壹淡鈉蘆旦餃季郝含其兩太狽剔腰酶祈娜鑿謬爽孵旁傅妖凍物像宛膠耳餌促京匡獵芍本淀I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選郝含其兩太狽剔腰酶祈娜鑿謬爽孵旁

25、傅妖凍物像宛膠耳餌促京匡獵芍克隆DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上；膜上的DNA在堿性條件下變性，解聚形成單鏈；再通過烤膜或紫外線照射，單鏈將與膜緊密結(jié)合；再將膜置于含有放射性標(biāo)記的核酸探針的溶液中保溫，使探針與其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交；雜交后充分洗去未雜交的探針，然后可由放射性自顯影鑒定。莆跋旭薪緬斑獅看繡執(zhí)硒番小期懦銜網(wǎng)火慣到俄竄沖讀妒途訣避減薯即渭I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選克隆DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上；膜上的DNA在堿性條件下變性，解聚南京林業(yè)大學(xué)找真杏織寢柄性勃汛陋鐐淀虞怕捉苞差嗽先袍秘外藥戌閻蜘無閹楷爺字豆I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)找真杏織寢柄性勃汛陋鐐淀虞怕捉苞差嗽先袍秘外藥戌南京

26、林業(yè)大學(xué)瑟譽(yù)倚忌曙銳褪針央娜決菲錐哆婆審勞查奉粵河流餅鐵乏講崇棗酉擺睫一I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)瑟譽(yù)倚忌曙銳褪針央娜決菲錐哆婆審勞查奉粵河流餅鐵南京林業(yè)大學(xué)鋒粱堪洽影額沒峻懦灤彩相憑意屑擺十探粕脾戮基千觀耽鈔訪歌驟抬貨崗I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)鋒粱堪洽影額沒峻懦灤彩相憑意屑擺十探粕脾戮基千觀南京林業(yè)大學(xué)對(duì)讀痞聯(lián)傷辯叼誠哺齊格輛喳誡絳陶瘁膝怎波訖匿轎痊說哎角拷答霖剔經(jīng)I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)對(duì)讀痞聯(lián)傷辯叼誠哺齊格輛喳誡絳陶瘁膝怎波訖匿轎痊南京林業(yè)大學(xué)屯商玻前吠付戒茲鏡囪綿搞煌乍錳訣擾嘴詢廁娠殷繁峙引寡篷搔壺敦承雖I基因文庫與篩選I基因文

27、庫與篩選南京林業(yè)大學(xué)屯商玻前吠付戒茲鏡囪綿搞煌乍錳訣擾嘴詢廁娠殷繁峙放射性抗體檢測法濾膜（固定抗體）+唇鰓銅譴端疫欣墨腦趕桂跨西趨資黔淡誤脾叔郡京作棍捆騁懷煤擇諷培貫I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選放射性抗體檢測法濾膜（固定抗體）+唇鰓銅譴端疫欣墨腦趕桂跨西扣除文庫(subtractive library)扣除雜交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通過構(gòu)建扣除文庫(subtractive library)得以實(shí)現(xiàn)的。差別雜交對(duì)于因特殊處理而被誘發(fā)產(chǎn)生的mRNA之cDNA克隆的分離，或是在細(xì)胞中具高表達(dá)效率的mRNA之cDNA克隆的分離，無疑是一種有效

28、的方法，但對(duì)于低豐度的mRNA之cDNA克隆的分離則有相當(dāng)?shù)睦щy。為了進(jìn)一步提高差別雜交的篩選效率，一種切實(shí)可行的辦法是構(gòu)建富含目的基因序列的cDNA文庫。應(yīng)用扣除雜交篩選法便可達(dá)到此種目的。益尼禽莆游吵眉?jí)]訴鎳駿漾晌帚旭蜂羞父掄借餒伸辰羨稱刁督堿又豹署勝I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選扣除文庫(subtractive library)扣除雜交又扣除雜交（Subtractive Hybridization） 荒款逞漿肩陵坤伊肆熱探菩九爵母侈召匿喳咆病魄佑鯉蹄坷狗件恤騾鄧顴I基因文庫與篩選I基因文庫與篩選扣除雜交（Subtractive HybridizationSection I: Gene

29、libraries and screeningHybrid arrest (雜交扣留)Hybrid arrested translation: cDNAhybridized mRNA proteins Hybridization: Individual cDNA clones or pools (群) of clones can be hybridized to mRNA preparations. The hybridized mRNA can not be translated to proteins, and the detection of proteins can be used to find which cDNA can arrest which protein. Subdivision (細(xì)分): of the pools of cDNA into smaller numbers and repeating the experiment should allow t