基因分型檢測(cè)試劑盒常見問題

1、關(guān)于基因分型檢測(cè)試劑盒常見問題第1頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四目 錄試驗(yàn)開展實(shí)驗(yàn)室要求HPV臨床樣本的采集方法及注意事項(xiàng)臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題第2頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四HPV基因分型檢測(cè)試驗(yàn)項(xiàng)目 試驗(yàn)開展實(shí)驗(yàn)室要求第3頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的一般原則各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字方針”第4頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作流程 進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)必須遵循嚴(yán)格的單一方向順序!第5頁，共58頁，2022年，5

2、月20日，8點(diǎn)13分，星期四最佳的HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局 出口 入口工作流向臨床樣本收集與儲(chǔ)存PCR前區(qū)域PCR后區(qū)域第6頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四最佳的HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局每間房間必須有其專用的工作服及一次性手套；每個(gè)工作區(qū)都應(yīng)有獨(dú)立的一套儀器設(shè)備及耗材； 不同區(qū)域的儀器設(shè)備及耗材不能混用;臨床樣本(原始容器中)樣本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)超凈工作臺(tái)DNA提取PCR擴(kuò)增區(qū)導(dǎo)流雜交區(qū)結(jié)果通知患者第7頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四基礎(chǔ)HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局（1） 臨床樣本(原始容器中)樣本制備區(qū)超凈工作臺(tái)DNA提取導(dǎo)流雜交區(qū)結(jié)果通知患者PC

3、R區(qū)域第8頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四基礎(chǔ)HPV基因分型實(shí)驗(yàn)室布局（2） 每個(gè)區(qū)域必須有其專用的工作服及一次性手套；每次操作必須更換；涉及到公用儀器使用，必須注意防止交叉污染，定時(shí)使用次氯酸鈉溶液擦洗；第9頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四實(shí)驗(yàn)室環(huán)境注意事項(xiàng) 工作區(qū)域必須始終保持清潔整齊；所有實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及地面均應(yīng)保持清潔；所有實(shí)驗(yàn)廢料及垃圾使用專用垃圾帶裝好后，封口處理；在每次工作前后對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行消毒液（次氯酸溶液）擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后開啟紫外燈進(jìn)行滅菌；第10頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四實(shí)驗(yàn)室制度

4、及人員配備 有效的臨床結(jié)果嚴(yán)格規(guī)章制度并遵守操作人員具有專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn) 強(qiáng)烈責(zé)任感工作態(tài)度認(rèn)真細(xì)心嚴(yán)格遵守HPV基因分型各項(xiàng)工作的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程第11頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四實(shí)驗(yàn)所需儀器HybirMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀PCR擴(kuò)增儀超凈工作臺(tái)水浴鍋離心機(jī)旋渦混合儀微量移液器第12頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四HPV基因分型檢測(cè)試驗(yàn)項(xiàng)目 HPV臨床樣本的采集方法及注意事項(xiàng)第13頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四HPV臨床樣本的采集方法及注意事項(xiàng)標(biāo)本收集 標(biāo)本保存第14頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)1

5、3分，星期四標(biāo)本收集檢查前告知病人注意事項(xiàng)：月經(jīng)正常婦女，在月經(jīng)來潮后1018天為最佳檢查時(shí)間。檢查前48小時(shí)內(nèi)不要作陰道沖洗，不要用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物。檢查前48小時(shí)最好不要行性生活。檢查前不進(jìn)行醋酸或碘液涂抹。第15頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四標(biāo)本收集步驟 先脫掉褲子，然后按醫(yī)生指示仰臥于一張檢查床上。 步驟二 由醫(yī)生以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸。 然后使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口采集標(biāo)本。（最好在取樣前先用棉簽擦去宮頸分泌物）第16頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四標(biāo)本收集 步驟四 慢慢取出宮頸刷，將其放入標(biāo)有病人編號(hào)的取樣管中，

6、取樣管內(nèi)已加有專用細(xì)胞保存液，折斷其刷頭入管中，擰緊瓶蓋。 步驟三 將專用宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動(dòng)宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈。 第17頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四標(biāo)本保存樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。如若不能馬上送檢樣本，請(qǐng)于4保存，請(qǐng)?jiān)?個(gè)星期之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。第18頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四標(biāo)本收集標(biāo)準(zhǔn)收集中注意事項(xiàng)：使用凱普專用取樣器及保存液，可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，保持DNA完整性。樣本收集中為保留足夠的宮頸細(xì)胞標(biāo)本，注意切勿將宮頸刷頭丟棄。宮頸保存系統(tǒng)包裝打開后，必須立即進(jìn)行采樣，并連同刷頭置于取樣管中。如果同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢

7、查，應(yīng)先采細(xì)胞學(xué)樣品。 宮頸刷頭折斷、試驗(yàn)取樣時(shí)，請(qǐng)小心操作，切忌大力震蕩取樣管，造成試劑及樣本濺出影響檢測(cè)結(jié)果或造成污染。取樣管上標(biāo)示的名稱須與患者一一對(duì)應(yīng)。取樣后，切記擰緊取樣管管蓋。第19頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 HPV基因分型檢測(cè)試驗(yàn)項(xiàng)目 臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)第20頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問題分析第21頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四移液器：嚴(yán)禁大力來回?cái)Q動(dòng)；嚴(yán)禁調(diào)至容量之外使用；第二檔為排空檔，不得作吸取之用；吸頭應(yīng)浸入液面23mm處吸??；嚴(yán)禁將有液體的移液器平放或倒置；混勻沉淀

8、時(shí)，將吸頭緊貼于沉淀上方管壁，反復(fù)吸取液體，將沉淀反復(fù)混勻，溶解；每周用75%乙醇清洗一次，若有污染隨時(shí)清洗。第22頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四（二）實(shí)驗(yàn)室布局不合理引起的污染問題1、樣品處理不進(jìn)行隔離，樣品中各種核酸片 段均會(huì)通過空氣進(jìn)行傳播。2、PCR結(jié)果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和其它實(shí)驗(yàn)室在一 起，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的擴(kuò)增子污染。3、儀器設(shè)備及工作服等（尤其是加樣器）公 用，也會(huì)造成嚴(yán)重污染。4、實(shí)驗(yàn)室操作垃圾（吸頭、離心管、樣品杯 等）亂 放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實(shí)驗(yàn)室 污染。 第23頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四（三）PCR操作中存

9、在問題分析1.陽性變陰性2.陰性變陽性3.PCR結(jié)果不穩(wěn)定第24頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四1.陽性變陰性 (1) 有些陽性病人，經(jīng)過PCR檢測(cè)后為陰性，可能有兩種情況： 一是采集標(biāo)本方法或部位不正確， 二是如果病人取樣部位病原體消失，需根據(jù)病人的病理情況采樣。第25頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四(2) 標(biāo)本保存不當(dāng)，可引起PCR失敗。 收集的標(biāo)本亂放（未放冰箱），病原體的破裂，檢測(cè)的核酸降解，失去了PCR檢測(cè)的模板或造成標(biāo)本污染。第26頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四2.陰性變陽性 常見的原 因有以下5點(diǎn)： 第27

10、頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾篩的吸頭避免污染 （將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時(shí)，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應(yīng)，所有并非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)）。 第28頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 打開標(biāo)本管蓋引起樣品飛濺 （打開前須瞬間離心） 操作時(shí)手套引起的交叉污染 （拿過模板DNA管后應(yīng)更換手套） 第29頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 不明原因引起公用試劑污染 （必須設(shè)置一個(gè)不含模板DNA但含PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對(duì)照反應(yīng)。這一對(duì)照管須在準(zhǔn)備好所有其他PCR

11、以后才進(jìn)行吸加）。 實(shí)驗(yàn)室污染 第30頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方面HPV分型檢測(cè)試驗(yàn)操作方面 DNA提取 PCR擴(kuò)增 導(dǎo)流雜交(詳見各項(xiàng)操作的SOP）第31頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方面一、實(shí)驗(yàn)室分獨(dú)立房間操作: 樣本儲(chǔ)存區(qū)（與試劑儲(chǔ)存分開） PCR前區(qū)域 (試劑貯存及準(zhǔn)備區(qū), 樣本處理區(qū)) PCR后區(qū)域 (PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)) 儀器及耗材獨(dú)立使用，切忌前后區(qū)域交叉！試驗(yàn)工作服及手套獨(dú)立二、單一工作流程: PCR前區(qū)域 PCR后區(qū)域三、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 （防止污染、保持清潔整

12、齊、嚴(yán)格制定及執(zhí)行各項(xiàng)規(guī)章）四、試劑管理及標(biāo)本管理 試劑按要求溫度貯存、注意有效期，使用過的試劑擰緊歸類放好； 樣本清楚標(biāo)記好樣本號(hào)、與試劑分開貯存，使用過的樣本歸類放好五、以謹(jǐn)慎的態(tài)度對(duì)待，并清楚記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果及一些突發(fā)性問題；第32頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) DNA提取 使用移液器吸取臨床樣本時(shí)，避免移液槍頭碰到樣本管壁。所用移液槍頭均為一次性用品，切忌重復(fù)使用；防止造成樣本交叉污染防止造成試劑被污染 正確使用移液器第33頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) DNA提取盡可能使用帶有濾心的移液器槍頭防止

13、形成氣溶膠污染實(shí) 驗(yàn)室環(huán)境防止樣本DNA污染 移液器槍管第34頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) DNA提取DNA提取操作步驟注意事項(xiàng)：加入溶液之前, 應(yīng)確保溶液中沒有沉淀出現(xiàn)! 以免影響提取效率.加入臨床樣本時(shí),最好在超凈工作臺(tái)前操作,且將用過的槍頭打入到盛有10次氯酸鈉的廢液瓶中, 以免樣品交叉污染,影響以后的PCR檢測(cè).在煮沸樣品時(shí),切記不要讓沸水濺入到樣品管中!建議水沸騰后調(diào)低火力.每次去上清時(shí),盡量去干凈,特別是第3步驟, 以免影響提取效果.在做PCR之前,最好將提取的樣品離心5分鐘, 取樣時(shí)盡量不要將槍尖碰到管底的沉淀。第35頁，共58頁，

14、2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) PCR擴(kuò)增正確使用移液槍防止造成樣本交叉污染防止造成試劑被污染第36頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) PCR擴(kuò)增盡可能使用帶有濾心的長(zhǎng)頭移液器槍頭防止形成氣溶膠防止樣本DNA交叉污染防止樣本污染試劑第37頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) PCR擴(kuò)增防止造成試劑被污染移液槍頭均為一次性用品,切忌重復(fù)使用移液槍頭盡可能為帶有濾芯每個(gè)區(qū)域必須用專用儀器、耗材。進(jìn)入不同房間必須穿專用工作服及帶手套，離開時(shí)必須先脫去工作服及手套。PCR后操作區(qū)域房間內(nèi)的

15、所有耗材及儀器均不能與PCR前區(qū)域混合使用。使用前后均以次氯酸消毒液清理。第38頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) PCR擴(kuò)增HPV 58HPV 18HPV 16PCR操作不當(dāng)造成污染：第39頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 導(dǎo)流雜交雜交及雜交后清洗溫度（45C ）。每次清洗膜后，抽液干凈。確保PCR產(chǎn)物變性成功。遵守封阻反應(yīng)溫度及時(shí)間、酶標(biāo)反應(yīng)時(shí)間及顯色反應(yīng)時(shí)間，確保雜交結(jié)果背景正常。正確使用移液器，移液槍及槍頭專用。第40頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四HPV基因分型檢測(cè)試驗(yàn)項(xiàng)目

16、臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題 第41頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題HPV陽性正常結(jié)果 HPV陰性正常結(jié)果第42頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題一、雜交結(jié)果中IC點(diǎn)不清楚，同時(shí)陽性點(diǎn)也不清楚或比較淡；可能原因： 雜交溫度控制不當(dāng)，出現(xiàn)非特異性雜交點(diǎn)； DNA樣本中有對(duì)PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì)，影響了 PCR擴(kuò)增的效率； 確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，在使 用前再次變性PCR產(chǎn)物。 病人樣本是否取樣前是否違反了取樣要求？將DNA樣本稀釋10倍后，重新PCR擴(kuò)增及雜交反應(yīng)可解決。第43頁，共58

17、頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題二、雜交結(jié)果中，在雜交膜上既無IC點(diǎn)，也沒有HPV分型陽性點(diǎn)顯色；可能原因：可能是因?yàn)镈NA模板中存在抑制PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì)，首先, 通過抽提得到的DNA的純度對(duì)PCR反應(yīng)會(huì)有很大影響,所以必 須在做PCR模板的時(shí)候?qū)⑵湎♂審亩档虳NA溶液中抑制劑的 濃度,使得PCR反應(yīng)能正常進(jìn)行，在一家新的醫(yī)院開始試驗(yàn)的時(shí) 候均需要摸索本院樣本自身的特點(diǎn)。 或者所取樣本，不符合凱普HPV分型檢測(cè)說明書中對(duì)樣本的 要求，樣本之前經(jīng)過碘染色或者病人使用了陰道沖洗藥物，均 會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制。 確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，

18、在使用前再次變 性PCR產(chǎn)物。 如果這些情況的時(shí)候，建議對(duì)樣本稀釋10倍重新PCR，然后雜交， 結(jié)果仍然不成功的情況下，建議按照凱普說明書要求重新取樣 檢測(cè)。第44頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題402721403022403040403078稀釋 1:10 DNA模板重復(fù)PCRHPV 58HPV 18IC (+) HPV 51弱 IC, HPV 52第45頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題三、雜交結(jié)果中IC點(diǎn)沒有，同時(shí)陽性點(diǎn)淡或不清楚；可能原因： 樣本中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)； 樣本中HPV

19、DNA濃度較低，同樣本中 含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)； 病人樣本不符合凱普分型試驗(yàn)要求，樣本本身 為陰性結(jié)果，但因?yàn)闃颖局杏幸种芇CR反應(yīng)的物 質(zhì)，同時(shí)操作人員對(duì)雜交溫度又控制不當(dāng)，出 現(xiàn)非特異性雜交點(diǎn)； 建議增加用于擴(kuò)增DNA濃度，重新PCR擴(kuò)增及雜交反應(yīng)。第46頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題四、IC點(diǎn)弱或者沒有，但HPV分型陽性點(diǎn)顯色正常可能原因： 由于IC和HPV DNA之間存在競(jìng)爭(zhēng)，高 濃度的HPV DNA可能會(huì)對(duì)IC點(diǎn)的擴(kuò)增反 應(yīng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，此現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)如 HPV分型點(diǎn)顯色正常，則認(rèn)為分型結(jié)果 正確。第47頁，共58頁，2022年

20、，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題六、Biotin（生物素）點(diǎn)不顯色可能原因：請(qǐng)確認(rèn)所使用試劑是否仍在有 效期內(nèi)。尤其是酶標(biāo)液及顯色 液是否按要求使用及儲(chǔ)存。 確定實(shí)驗(yàn)操作是否嚴(yán)格按照說 明書進(jìn)行、且試劑是否按要求保 存使用。第48頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題七、陰性對(duì)照顯現(xiàn)HPV分型陽性點(diǎn)可能原因：PCR試劑可能被污染，取5 l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳分析。 重復(fù)進(jìn)行PCR及雜交試驗(yàn)。第49頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題八、雜交膜有很高的背景可能原因：

21、可能由于封閉不足，使未結(jié)合 的酶標(biāo)殘留在膜上。確保封閉液 完全覆蓋整個(gè)雜交膜。 也可能因?yàn)闆]有完全將未結(jié)合 的試劑清洗干凈，請(qǐng)確保在顯色 過程中雜交膜充分清洗，無剩余 殘留液體。第50頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題九、封阻液抽不動(dòng) 可能原因： 仔細(xì)觀察封阻液是否有絮狀微 生物或澄淀，如果有則證明封阻 液有發(fā)霉跡象，是由于操作中沒 有使用滅菌槍頭而造成的。 重新購(gòu)買封阻液，同時(shí)確保試驗(yàn)中使用已滅菌的移液槍頭第51頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題十、什么時(shí)候需要做陽性及陰性對(duì)照 當(dāng)一個(gè)新的醫(yī)院，一

22、個(gè)新的地方開展試驗(yàn)的時(shí)候，或更換試驗(yàn)地點(diǎn)的時(shí)候，需要進(jìn)行陰陽性對(duì)照試驗(yàn)； 當(dāng)使用的檢測(cè)試劑批次改變的時(shí)候需要做1次陰陽性對(duì)照；當(dāng)雜交結(jié)果出現(xiàn)令人疑惑，比如多個(gè)樣本的雜交結(jié)果一樣，或者雜交結(jié)果出現(xiàn)過多的多重感染，以及雜交試驗(yàn)后出現(xiàn)許多無IC點(diǎn)及陽性雜交點(diǎn)的結(jié)果等情況下，需要使用同批試劑進(jìn)行陰陽性對(duì)照試驗(yàn)以驗(yàn)證問題所在；第52頁，共58頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四臨床試驗(yàn)結(jié)果分析及常見問題十一、導(dǎo)流雜交試驗(yàn)中的污染主要會(huì)出現(xiàn)在那一步中，應(yīng)該怎樣防范？首先，污染情況主要由PCR操作中樣本DNA的交叉而產(chǎn)生；對(duì)于此種情況，應(yīng)嚴(yán)格按照SOP操作，確保PCR加樣的試驗(yàn)器材均為專用，特別是移液槍和槍頭。其次，雜交結(jié)果中出現(xiàn)的比較弱的雜交點(diǎn)不是污染造成，而是雜交溫度不符合要求而造成的非特異性點(diǎn)。對(duì)于此種情況，應(yīng)在雜交操作的時(shí)候，確保雜交液的45