實驗九-動物組織中DNA的提取與鑒定課件

1、實驗九 動物組織中DNA的提取與鑒定 一、實驗目的掌握DNA的提取方法。二、實驗原理 DNA+RNAPrPr+DNPRNPDNP在1mol/L NaCl中溶解度最大 RNP在0.15mol/L NaCl中溶解度最大 可分離DNP和RNP二苯胺 二苯胺法鑒定DNA酸解脫氧核糖 嘌呤 -羥基-酮基戊醛 藍色的化合物SDSDNAPrDNP氯仿-異戊醇 除去蛋白質(zhì) 95%的乙醇 沉淀幾個試劑的作用檸檬酸鹽、EDTA 防止DNA酶對DNA的降解 （可螯合除去DNA酶活性所需的Mg2+， 抑制DNA酶的活性）SDS氯仿-異戊醇除去變性蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)變性 三、操作 1、制備勻漿： 稱取新鮮動物肝臟5g，置于

2、研缽中，剪碎，加2倍組織重的冷0.15mol/LNaCl0.015mol/L檸檬酸鈉溶液(10mL)，研磨成漿狀，得勻漿液。 （一）DNA的提取 2、抽提DNP粗制品 將勻漿液（除去組織碎片）轉(zhuǎn)移至離心管中，4000r/min離心10min，棄去上清夜，收集沉淀(內(nèi)含DNP)。向沉淀中加兩倍體積(10mL)的冷0.15mol/LNaCl0.015mol/L檸檬酸鈉溶液，攪勻，如前離心，重復洗滌23次。所得沉淀為DNP粗制品，移至燒杯中。 3、DNA與蛋白質(zhì)分離 向沉淀中加入冷0.15mol/LNaCl-0.1mol/LEDTA-Na2溶液，使總體積達到8mL，在緩慢攪拌的同時滴加5% SDS溶

3、液2mL，使SDS最終濃度達 1%，邊加邊攪拌，使DNA與蛋白質(zhì)分離。 再加入5mol/L NaCl溶液2.5mL，使NaCl最終濃度達1mol/L，攪拌10min（速度要慢），溶液變得黏稠并略帶透明。 4、除蛋白質(zhì)、糖等雜質(zhì) 最后加入等體積的冷氯仿-異戊醇混合液，攪拌20min，4000r/min離心10min，分層情況：上層為水相（含DNA鈉鹽），中層為變性的蛋白質(zhì)沉淀，下層為氯仿-異戊醇混合液。 用吸管小心地吸取上層水相，棄去沉淀，再在相同條件下重復抽提23次。上清液（含DNA鈉鹽）用于做以下實驗。 5、沉淀DNA 取上清液5mL放入干燥的試管（小燒杯）中，加入2倍體積預冷的95%乙醇。

4、加入時，用滴管吸取乙醇，邊加邊用玻璃棒慢慢順一個方向在試管（燒杯）內(nèi)轉(zhuǎn)動，隨著乙醇的不斷加入可見溶液出現(xiàn)黏稠絲狀物質(zhì)，并能逐步纏繞于玻璃棒上，直至再無黏稠絲狀物出現(xiàn)為止。黏稠絲狀物即是DNA。四、結(jié)果（二）DNA的鑒定 用二苯胺法鑒定DNA。取上清液2mL于試管中，加入二苯胺試劑5mL，6080加熱15min，另外做一個空白對照：取2mL水于試管中，加入二苯胺試劑5mL，6080加熱15min，觀察顏色。2mL 上清夜2mL 水二苯胺試劑5mL, 6080加熱顏色？顏色？15min（1）0.15mol/LNaCl0.015mol/L檸檬酸鈉溶液（pH7.0）：稱取8.77gNaCl，4.41g

5、檸檬酸三鈉（Na3C6H5O72H2O），用約800mL蒸餾水溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.0，最后定容至1000 mL。 （2）0.15mol/LNaCl0.1mol/LEDTA-Na2溶液（pH8.0）：稱取8.77gNaCl，37.2gEDTA-Na2溶于800 mL蒸餾水中，以0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0，最后定容至1000mL。 （3）5mol/LNaCl溶液：稱取292.2 gNaCl溶于800 mL蒸餾水中，最后定容至1000mL。（4）5%SDS溶液（W/V）： 稱取5gSDS，溶于100mL的 45%（V/V）乙醇中。（5）氯仿異戊醇溶液：按氯仿:異戊醇=24:1（V/V）配制。（6）95（V/V）乙醇。（7）二苯胺試劑： 稱取1 g重結(jié)晶的二苯胺，溶于100mL冰醋酸（AR）中，再加入濃度不低于60% 的過氯酸（AR） 10mL ，混勻待用。臨用前加入1mL 1.6%的乙醛溶液，配