大腸桿菌聚合酶作用和應(yīng)用

1、關(guān)于大腸桿菌聚合酶的作用與應(yīng)用第1頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三大腸桿菌DNA聚合酶 I的活性5-3DNA聚合酶活性15-3外切核酸酶活性23-5外切核酸酶活性3第2頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三5-3DNA聚合酶活性 在引物RNA-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol使DNA鏈沿5 3方向延伸。 3 Mg2+,dNTP 5 5 3 DNA聚合酶I第3頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三5-3外切核酸酶活性 從53方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配

2、對部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是53。 3 Mg2+ 5 5 3 DNA聚合酶I第4頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三3-5外切核酸酶活性 由3端水解DNA鏈，反應(yīng)底物是帶3-OH的雙鏈DNA或單鏈DNA，其活性從3-OH端降解ds-DNA，可被5 3聚合活性封閉，也可被帶5磷酸的dNMP抑制 5 Mg2+ Mg2+,dNTP 3 3 5 DNA聚合酶I DNA聚合酶I第5頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三活性能發(fā)生的反應(yīng)切口平移置換反應(yīng)活性第6頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三置換反應(yīng) 如果只有一種dNTP存在，

3、3 5外切核酸活性將從3-OH端降解DNA，而5 3聚合酶活性又在合成DNA，然后在該位置發(fā)生一系列的合成和外切反應(yīng)，直到露出與該dNTP互補(bǔ)的堿基。 3 5外切酶活性 5 3 5 3聚合酶活性第7頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三切口平移 首先在鎂離子存在下用少量DNaseI處理雙鏈DNA模板，產(chǎn)生少量切口。在切口處利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5-3外切核酸酶活性是切口沿5-3方向移動(dòng)，同時(shí)5-3DNA聚合酶活性又不斷合成DNA。 5 Mg2+ DNaseI 3 5 dNTP 大腸桿菌DNA聚合酶I 3 第8頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三應(yīng)用1

4、3-端的末端標(biāo)記2切口平移法標(biāo)記DNA3合成cDNA的第二鏈第9頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三3-端的末端標(biāo)記 先用此酶的35核酸外切酶活性，切除凸出的3-粘端，形成5-凸出粘端；在以其53聚合酶活性使其使其補(bǔ)平，在高濃度dNTP的條件下，3-端的外切反應(yīng)與dNTP的攙入反應(yīng)達(dá)到平衡。若dNTP中有放射性標(biāo)記的核苷酸，即可使產(chǎn)物成為3-末端的帶標(biāo)記的DNA。第10頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三切口平移法標(biāo)記DNA 在Dnase的作用的基礎(chǔ)上產(chǎn)生連內(nèi)切口，應(yīng)用此酶的53聚合酶活性和53外切酶活性的同步聯(lián)合反應(yīng)，使切口沿DNA鏈從5-端向3-端移動(dòng)。若用聚合反應(yīng)的原料dNTP帶有放射性核素-32P，就能使生成的雙鏈帶有標(biāo)記物。根據(jù)此原理可做DNA雜交探針。第11頁，共13頁，2022年，5月20日，20點(diǎn)4分，星期三合成cDNA的第二鏈 單鏈cDNA3-端可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，便于DNA聚合酶I發(fā)揮53聚合酶活性，合成cDNA的第二鏈。由于其具有5-3外切核酸酶活性，現(xiàn)在已不再用于