雪里蕻抗氧化方法

1、雪里蕻抗氧化能力的研究雪里蕻抗氧化活性成分的提取流程雪里蕻干燥-粉碎-分別用甲醇、75%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、水索氏浸提 2次提取液濃縮一濃縮液（保存?zhèn)溆茫┻€原力測(cè)定將提取物配成不同濃度，吸取2.5mL，加入2.5mL磷酸 緩 沖 溶 液 （pH6.6,0.2mol/L ）及 2.5mL, 1%K Fe（CN），置 50C恒溫水浴中反應(yīng) 20min 后迅速冷卻，再加入2.5mL10%的三氯醋酸，混合后離心，取上清液5mL,加入5mL 去離子水，1mL0.1%FeCl溶液?；旌暇鶆?，1min后于700nm處測(cè)其吸光值，以 去離子水作為空白。3提取物清除羥自由基的抗氧化能力測(cè)定采用H2O2/鄰二氮

2、菲一Fe2 +分光光度法，參照文獻(xiàn)的改進(jìn)，以蒸餾水將75 mmol/ L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋至18.75 mmol/ L ,依次往25 ml容量瓶 中加入提取物,18.75 mmol/ L鄰二氮菲溶液1.0 ml ,pH 7.4磷酸鹽緩沖液2 ml ,18.75 mmol/ L FeSO4 溶液 1.0 ml ,1 %（體積分?jǐn)?shù)）過氧化氫 110 ml ,以 蒸餾水補(bǔ)充至25. 00 ml。每加一次試劑均需混勻，在恒溫水浴鍋37 C恒溫1 h后在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用蒸餾水作空白。既加提取物溶液，又加過 氧化氫為測(cè)試樣品A1 ;不加提取物溶液，只加過氧化氫為損傷液A損；不加提 取

3、物溶液，也不加過氧化氫為末損傷液A末；只加藥液和蒸餾水，不加其它溶 液為測(cè)試樣校對(duì)液A校，A = A1 - A校。按下式計(jì)算表觀羥自由基清除率： d = （A - A 損）/ （A 末-A 損）X100 %。提取物清除O2- 的抗氧化能力測(cè)定用pH值為7.4的混合磷酸鹽緩沖溶液作溶劑，配制含3.3 X10 - 6mol/ L 核黃素，0.01mol/ L蛋氨酸，4.6 X10 - 5mol/ L NBT的自由基體系注：自由基 體系需現(xiàn)用現(xiàn)配且避光保存，光照燈為40W白熾燈，燒杯距燈1012cm ,用 50mL燒杯各取10mL自由基體系和提取的乙醇提取液，在25 C下，置于光照 箱中光照30mi

4、n ,以蒸餾水作為參比液，在確定的最大吸收波長(zhǎng)560nm處測(cè)定 提取液的吸光度A，同時(shí)以水代替提取物測(cè)定空白吸光度A0，按下式計(jì)算乙醇 提取液清除02- 的抗氧化能力。清除率 % =A 2- AX100fA 0提取物清除2,2 -連氮雙（3乙基苯并噻唑啉-6磺酸）二氨鹽（ABTS）ABTS自由基清除能力測(cè)定參照Thana等的方法 配制終濃度為7 mmol/LABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀的混合液室溫避光條件下靜置過夜（12 h）制得ABTS自由基儲(chǔ)存液，使用時(shí)用水稀釋至734 nm處吸光度為0.70+ 0.02的應(yīng)用液。100uL待測(cè)液加入3 mL ABTS應(yīng)用液充分混合室溫下避光

5、反應(yīng)6 min后測(cè)定其在734 nm處的測(cè)吸光度計(jì)算公式ABTS自由基清除率% 二（Ablank-Asample）* 100/Ablank5.提取物抗脂質(zhì)過氧化能力的測(cè)定（對(duì)卵黃脂蛋白不飽和脂肪酸（PUFA）體系所產(chǎn)生的ROO抑制能力）以Fe2誘導(dǎo)卵黃脂蛋白不飽和脂肪酸（PUFA）發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)為模型新 鮮卵黃用等濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液PBS（pH值為7.4）配成懸液， 再稀釋25倍，磁力攪拌器攪拌30 min,（新鮮卵黃用等體積的0.2 mol/L pH 7.4的PBS按1 : 1配成懸液，再稀釋成1 : 25（卵 黃：總體積），磁力攪拌30 min。）精確移取0.4 m

6、L,注入25 mL具塞試管中，再依次加入不同濃度的樣品提取 液（對(duì)照管加入相同體積的PBS ） 0.2 mL, 25 mmol/L的FeCl2溶液0.2 mL, 用PBS補(bǔ)足2.0mL置于37C水浴中振蕩50 min,取出，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% 的三氯乙酸0.50 mL終止反應(yīng)，靜置10 min, 3 000 r/min離心15 min取上 清液2.0mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%硫代巴比妥酸溶液1.0mL，于沸水中反應(yīng)15 min,冷卻，于532 nm處測(cè)定吸光度A值，以下式計(jì)算抑制率抑制率二A對(duì)照-A樣品X100 %A對(duì)照75 mmol/ L 鄰二氮菲（C12H8N2H2O198.22）無水

7、乙醇溶液：稱取 0.743g的鄰二氮菲溶于50ml的無水乙醇中18.75 mmol/ L鄰二氮菲無水乙醇溶液：于75 mmol/ L鄰二氮菲無水乙醇溶液 加蒸餾水到200ml,搖勻（每次用1.0 ml）pH 2. 0的HCl溶液：取1.67ml的12mol/L的濃鹽酸稀釋到1000mlp H 4. 0的乙酸鹽緩沖液：0.05mol/L 醋酸一0.05mol/L 醋酸鈉（16.4: 3.6）。搖勻，即得。p H 6. 0的磷酸氫鉀-磷酸二氫鉀緩沖液：取磷酸二氫鉀8.34g與磷酸氫二鉀0.87g,加水使溶解成1000ml,即得p H 7. 4的磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g,加0.1mol/L

8、氫氧化鈉溶液400ml,用水稀釋至1000ml，即得。p H 6. 88的磷酸鹽緩沖溶液,:取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml,加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml,用水稀釋至1000ml, 搖勻，即得。pH 8. 710. 8的碳酸鹽緩沖液：稱取1.59g碳酸鈉（Na2CO3）, 2.93g碳酸氫鈉（NaHCO3），加水稀釋至1000mL 搖勻，即得。3.3 X10 - 6mol/ L核黃素（C17H20N4O6 ） 376.36 本品在水、乙醇、氯仿 或乙醚中幾乎不溶；在稀氫氧化鈉溶液中溶解。取1.242mg溶于PH=7.4磷酸鹽 緩沖溶液（每次用10ml）0.01mol/ L

9、 蛋氨酸 （C5H11O2NS 149.21 ）溶于水（3.3g/100ml,25 C ）、 稀酸和稀堿。極難溶于乙醇，幾乎不溶于乙醚。:取1.492g溶于PH=7.4磷酸鹽 緩沖溶液（每次用10ml）4.6 X10 - 5mol/ L NBT 氯化硝基四氮唑藍(lán) 817.60:取 37.61mg 溶于 PH=7.4 磷酸鹽緩沖溶液（每次用10ml）然后用PH=7.4磷酸鹽緩沖溶液定容核黃素蛋氨酸NBT的混合液到1000ml7 mmol/LABTS C18H24N6O6S4 548.68:取 1.15223mg 溶于蒸餾水中 （每次用3 mL ）2.45 mmol/L過硫酸鉀270.32 :取198.6852mg溶于蒸餾水中（每次用3ml）然后用蒸餾水定容ABTS過硫酸鉀混合液到300ml0.2 mol/L新鮮卵黃（卵黃脂蛋白）一種磷脂蛋白（約135 kDa），鳥卵蛋黃中的 主要組分，與其共存的有卵黃高磷蛋白，兩者在肝臟中以一個(gè)大分子質(zhì)量前體蛋白 質(zhì)的形式（卵黃原蛋白）合成。需要用量 54g溶于水？中得2ml -稀釋25倍 得50ml（每次用稀釋25倍0.4 mL ）25 mmol/L 的 FeCl2 溶液（四水）198.8102 g :取 99.