科研實驗轉(zhuǎn)化為微生物學(xué)綜合教學(xué)實驗的探索與實踐

1、科研實驗轉(zhuǎn)化為微生物學(xué)綜合教學(xué)實驗的探索與實踐摘 要】將科研實驗“納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2”轉(zhuǎn)化為微生物學(xué)綜合教學(xué)實驗。利用響應(yīng)曲面設(shè)計不同的培養(yǎng) 基，通過對納豆芽胞桿菌的種子和發(fā)酵培養(yǎng)制備維生素K2產(chǎn)品，結(jié)合提取與液相分析技術(shù)探討不同營養(yǎng)組分對維生素K2的產(chǎn)量的 影響，優(yōu)化其發(fā)酵工藝。通過該綜合實驗融合前期微生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)的基礎(chǔ)實驗，讓學(xué)生系統(tǒng)掌握微生物制備營養(yǎng)化學(xué) 品的流程與方法，培養(yǎng)學(xué)生科研和創(chuàng)新思維，提高學(xué)生分析和解決生物工程領(lǐng)域?qū)嶋H問題的能力，為其未來升學(xué)和工作奠定基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】科研實驗;微生物學(xué)；綜合教學(xué)實驗；維生素K2;芽胞桿菌；發(fā)酵微生物學(xué)課程是生物工程、制

2、藥工程、生物技術(shù)等專業(yè)培養(yǎng) 方案中一門重要的專業(yè)基礎(chǔ)課,是一門實踐性、技術(shù)性很強(qiáng)的課 程，因此，微生物實驗是全面掌握該課程的重要環(huán)節(jié)口。通過微 生物實驗的學(xué)習(xí)，需要訓(xùn)練學(xué)生掌握微生物最基本的操作技能， 并進(jìn)一步深化微生物學(xué)的基本理論，培養(yǎng)學(xué)生通過觀察和試驗 進(jìn)行思考、分析問題和解決問題的能力。為強(qiáng)化微生物實驗的 教學(xué)效果,需加強(qiáng)微生物實驗涉及生物學(xué)知識的深度和廣度，提 高學(xué)生的創(chuàng)新和動手能力。目前，多個高校在微生物基礎(chǔ)實驗的基礎(chǔ)上加強(qiáng)創(chuàng)新性綜 合實驗的投入和實施效果，結(jié)合各高校的學(xué)科特色和研究方 向，改造和創(chuàng)新新型的綜合實驗內(nèi)容，提高學(xué)生實驗技能，培養(yǎng) 科研熱情時。我校生物工程和制藥工程專業(yè)首

3、批入選國家一 流本科專業(yè)，生物化工學(xué)科是國家重點學(xué)科和教育部國家特色 重點學(xué)科,近年來，在本科微生物實驗教學(xué)中，積極推進(jìn)綜合實 驗進(jìn)入科研實驗室，鼓勵科研教師開發(fā)設(shè)計新型綜合實驗并引 入教學(xué)，通過融合個人科研工作建立一批從科研工作中衍生的 創(chuàng)新性學(xué)生綜合實驗皿。微生物制備生物化學(xué)品是微生物現(xiàn) 有應(yīng)用中一個重要的分支，也是我校生物化工學(xué)科的特色研究 方向，但是當(dāng)前微生物教學(xué)中典型產(chǎn)品案例少，很多學(xué)生在學(xué) 習(xí)之后僅知道利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)啤酒或面包這種非常常規(guī)和 傳統(tǒng)的案例，因此可在微生物實驗教學(xué)中融入多種微生物制備 經(jīng)典生物化學(xué)品的案例，擴(kuò)大學(xué)生的知識面，增強(qiáng)學(xué)生對生物 技術(shù)行業(yè)的了解,l2,o本文

4、選取科研項目“納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2”中較 為成熟的部分，將其開發(fā)為微生物學(xué)的綜合性實驗，作為一個具 有代表性和綜合性的實驗，應(yīng)用于本科生微生物學(xué)的綜合實驗 教學(xué)中。該實驗涵蓋培養(yǎng)基的配置、微生物培養(yǎng)、發(fā)酵過程指標(biāo) 監(jiān)控、產(chǎn)物提取與檢測等實驗環(huán)節(jié)，能夠讓學(xué)生融合前期學(xué)習(xí)的 微生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)實驗，全面了解基 于微生物開發(fā)生物化學(xué)品的流程，體現(xiàn)了綜合實驗“綜合”的特 性。另外，該實驗中通過分組設(shè)置不同發(fā)酵條件并研究最終產(chǎn) 量差異，更利于培養(yǎng)學(xué)生分析實驗結(jié)果、思考問題的能力，啟發(fā) 學(xué)生科研和創(chuàng)新思維。1綜合教學(xué)實驗設(shè)計的相關(guān)背景維生素K2是一類脂溶性凝血類維生素，為甲

5、萘醌類系列 化合物，在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療方面具有顯著的效果，被 稱為“第四代抗骨質(zhì)疏松產(chǎn)品”。據(jù)報告，維生素K2具有抗動 脈鈣化和骨關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤、延緩衰老、修復(fù)損傷細(xì)胞等功效廣 泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。其安全性已得到中國食品藥品 監(jiān)督管理局、美國藥品研究所及歐洲議會和歐盟理事會的權(quán)威 認(rèn)定。目前,維生素K2的來源主要分為三種從食物中攝 取或由腸道微生物合成；（2）化學(xué)合成；（3）微生物發(fā)酵。但是， 食物中維生素K2的含量極少，化學(xué)合成法又存在前體原料來 源限制，產(chǎn)生大量異構(gòu)體，活性和產(chǎn)率低，污染環(huán)境等缺陷，微 生物發(fā)酵法具有條件溫和、可大規(guī)模生產(chǎn)、制備的維生素K2生 物相容性高和活性

6、高等優(yōu)點，被認(rèn)為是最具潛力的生產(chǎn)方法， 但目前仍存在維生素K2產(chǎn)量低等問題，限制了其工業(yè)化生 產(chǎn)|l3,o為了提高維生素K2的產(chǎn)量，本試驗主要采用響應(yīng)面優(yōu)化 的方法探究不同培養(yǎng)基對維生素K2產(chǎn)量的影響。該綜合實驗 將作為生物化學(xué)品開發(fā)領(lǐng)域的一個實驗案例，以芽孢桿菌的培 養(yǎng)和維生素類化學(xué)品的開發(fā)為模板，融合產(chǎn)品開發(fā)的不同環(huán) 節(jié),鞏固微生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)等學(xué)科的基本實驗知識 和技能，進(jìn)一步強(qiáng)化生物工程、制藥工程專業(yè)本科生的實驗設(shè) 計和理論聯(lián)系實際的能力。2綜合教學(xué)實驗的設(shè)計本課題通過培養(yǎng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)營養(yǎng)化學(xué)品維生素 K2,以提高維生素K2的產(chǎn)量為目的，在實驗過程中探索不同的 碳源、

7、氮源、無機(jī)鹽等因素的最優(yōu)配比，采用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基 來提高菌種維生素K2的產(chǎn)量。響應(yīng)曲面設(shè)計方法是利用合理 的試驗設(shè)計方法并通過實驗得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸 方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的 分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù),解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。 本實驗利用響應(yīng)曲面設(shè)計方法設(shè)計了 13種發(fā)酵培養(yǎng)基，通過測 定不同培養(yǎng)基條件下細(xì)胞密度OD值、PH值、甘油含量、維生素 K2含量的變化并繪制出曲線，根據(jù)數(shù)據(jù)對比獲得最合適的培養(yǎng) 條件。納豆芽抱桿菌菌種活化 一發(fā)酵培養(yǎng) 一產(chǎn)物提取產(chǎn)物分析細(xì)胞密度細(xì)胞形態(tài)發(fā)酵液pH甘油濃度萃取VK2產(chǎn)量分光光度計光學(xué)顯微鏡 pH計 滴定法旋轉(zhuǎn)

8、蒸發(fā)HPL基析$OD600形態(tài)圖片pH值濃度g/L濃度g/L濃度g/L圖1實驗流程圖2.1實驗?zāi)康模?）以維生素K2產(chǎn)品為例了解基于微生物培養(yǎng)制備生物化 學(xué)品的原理和方法，掌握產(chǎn)品開發(fā)過程的微生物培養(yǎng)、發(fā)酵過程 控制、產(chǎn)物提取、產(chǎn)物分析各個環(huán)節(jié)的關(guān)鍵點。（2）了解利用響應(yīng)面設(shè)計多因素多水平實驗的方法,掌握培 養(yǎng)基配置、微生物無菌操作、分光光度法測定細(xì)胞生物量、滴定 法檢測甘油濃度、高效液相色譜檢測VK2等基本操作方法。（3）培養(yǎng)學(xué)生綜合應(yīng)用前期所學(xué)基礎(chǔ)實驗完成連續(xù)性綜合 實驗的能力，激發(fā)學(xué)生科研熱情，提高學(xué)生分析問題、解決問題 的能力141o（4）探究納豆芽孢桿菌產(chǎn)維生素K2的最佳培養(yǎng)條件，為

9、產(chǎn) 量提升提供指導(dǎo)。2.2實驗原料與儀器實驗試劑：牛肉膏（生化試劑，上海凌峰化學(xué)試劑有限公 司）、大豆蛋白胨（生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、酵母 粉（生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甘油（分析純、國藥 集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）,葡萄糖（分析純、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有 限公司）、磷酸氫二鉀（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）、氯 化鈉（分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司）、葡萄糖（分析純，國 藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氯化鈣（分析純，汕頭市西隴化工廠 有限公司）、七水合硫酸鎂（分析純，上海美興化工股份有限公 司）、酚酞（分析純,上海美興化工股份有限公司）、異丙醇（分析 純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑

10、有限公司）、正己烷（分析純，南京萬隆實 業(yè)有限公司）、氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、 高碘酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。實驗儀器:意大利BEL電子分析天平、雙人凈化工作臺、恒 溫振蕩搖床、立式壓力蒸汽滅菌器、雙目生物顯微鏡、Perkins Elmer 紫外/可見分光光度計、高速臺式離心機(jī)、生物傳感分析儀、 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵、Dionex高效液相色譜。2.3實驗內(nèi)容2.3.1納豆芽池桿菌的培養(yǎng)與發(fā)酵（ 1 ）配置培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖3%，pH 7.0-7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油5%，大豆蛋

11、白胨 3%，酵母粉0.06%，磷酸氫二鉀0.03%，氯化鈣0.01%，七水合硫 酸鎂0.03%o響應(yīng)面法設(shè)計的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下表所示，其余 組分相同。表1響應(yīng)面設(shè)計的13種培養(yǎng)基編號甘油g/L大豆蛋白胨g/LIJHPO3HOg/L140306.75280306.753401006.754801006.75540650.393680650.3937406513.18806513.1960300.39310601000.39311603013.1126010013.11360656.75按照上述配比配置種子和發(fā)酵培養(yǎng)基，每50ml分裝于250ml的搖瓶中，包扎,121C滅菌30mino（2）種子

12、的活化將低溫保藏的納豆芽孢桿菌菌種（Bacillus subtilis natto）接 入裝有含50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，紗布封口，培養(yǎng) 溫度37C ,轉(zhuǎn)速120rpm,搖床培養(yǎng)16小時;按照5%的接種量接 種至新鮮種子培養(yǎng)基中，同樣條件下活化第二代,獲得種子液。（3）發(fā)酵培養(yǎng)取活化好的二代種子液2ml分別接種到裝有含50ml發(fā)酵培 養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，培養(yǎng)溫度37C，轉(zhuǎn)速200rpm,培養(yǎng) 72h,在發(fā)酵過程中按照間隔時間取樣，檢測發(fā)酵過程中的各項 指標(biāo),至發(fā)酵結(jié)束后，從搖床中拿出。2.3.2發(fā)酵過程指標(biāo)的監(jiān)控（1）微生物形態(tài)監(jiān)控每隔12h取樣，制片，采用Leica

13、DM1000顯微鏡拍攝不同發(fā) 酵條件及不同時間下納豆芽孢桿菌的形態(tài)。（2）OD值測定OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。每隔 24h取樣,以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，測定一次OD600值, OD的范圍在0.20.8之間。（3）底物消耗測定取2mL發(fā)酵液于12000rpm下離心5min,移1mL上清液于 250mL錐形瓶中，加蒸餾水10mL,加兩滴酚酞試劑，用0.05mol/L 的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至變色，記錄NaOH用量V1。然后加入 10mL0.1mol/L高碘酸鈉溶液,避光反應(yīng)5min，再加入乙二醇（體 積分?jǐn)?shù)25%）5mL,避光反應(yīng)5mino然后用NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至 變

14、色，記錄NaOH用量V2。甘油含量計算:用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示：甘油含量（%）=92.1XcX（V2-V1）/mX100%其中：c表示所用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度;m表示試樣的質(zhì)量2.3.3產(chǎn)物的提取與分析維生素K2的提取:將10mL發(fā)酵液移入250mL帶擋板的錐 形瓶中，向發(fā)酵液中加入異丙醇和正己烷（1 : 2 : 4）,在搖床上 210rpm振蕩30min，靜置分層后，取上清旋蒸，記錄產(chǎn)物的質(zhì)量， 冷凝下來的正己烷回收。將所得的產(chǎn)物用異丙醇洗出，定容到 10mL的棕色容量瓶中。維生素K2的液相色譜檢測:液相條件：C18柱、流動相： 100%甲醇、流速：1.0mL/min、進(jìn)樣量：30以、柱溫：50

15、T、波長： 270nm 響。2.4實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果（1）通過響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的研究，我們獲得了不同培 養(yǎng)基條件下的維生素K2產(chǎn)量（如圖），其中最優(yōu)培養(yǎng)基為12號培 養(yǎng)基，其維生素K2產(chǎn)量達(dá)道31.18mg/ L,較優(yōu)化之前提高了 114.59%，該培養(yǎng)基組分為：甘油60g/L，大豆蛋白胨100g/L， K2HPO4-3H2O 13.1g/L。（2）提供的碳源越多，其消耗速率越快，在獲得充足碳氮源 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納豆芽孢桿菌，其生物量不斷上升，最大值達(dá) 成的原理，通過實驗方案的設(shè)計和具體操作培養(yǎng)學(xué)生動手實踐 能力，通過實驗現(xiàn)象的捕捉和數(shù)據(jù)分析提高學(xué)生對實驗結(jié)果的 解析能力，有助于激發(fā)學(xué)生的科

16、研熱情,培養(yǎng)創(chuàng)新意識|l6,o該綜合實驗是連續(xù)性實驗，前序?qū)嶒灥某蓴Q定后續(xù)試驗 是否順利進(jìn)行，尤其是實驗中涉及到無菌操作、旋蒸和液相色譜 分析等操作，在教學(xué)過程中需要注意:（1）無菌操作決定微生物 實驗的成敗,尤其是在微生物接種、取樣等操作過程中，需要嚴(yán) 格控制無菌；（2）產(chǎn)物提取過程需要用到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，在操作中需 要注意抽真空加熱等操作（3）液相分析過程中，注意樣品的預(yù) 處理以及流動相的配置和預(yù)處理，避免出現(xiàn)堵塞色譜柱的現(xiàn)象；（4）建議實驗分組進(jìn)行，不同條件各分配2人一組，設(shè)置平行樣 本，進(jìn)行培養(yǎng)基的配置接種等操作，過程指標(biāo)的檢測和分析，可 以分別取樣，一同分析，提高效率。2.5思考與討論（1）在不同的培養(yǎng)基組成中，氮豐富和氮限制的培養(yǎng)條件下 VK2的產(chǎn)量發(fā)生了哪些變化？（2）納豆芽孢桿菌的細(xì)胞形態(tài)在