轉(zhuǎn)錄調(diào)控-研究生教學(xué)課件

1、真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 的進(jìn)展和方法 周 建 林一、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)(略)二、真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控三、真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究方法轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控順式作用元件(cis-acting element)反式作用因子(trans-acting factor)順式作用元件是指對基因表達(dá)有調(diào)控活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處于一個DNA分子上的基因非編碼序列分為：啟動子、增強(qiáng)子、沉默子、絕緣子反式作用因子trans-acting factor概念：通過識別和結(jié)合順式作用元件的核心序列,而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄效率的一類蛋白因子（轉(zhuǎn)錄因子），對基因表達(dá)調(diào)控可正(激活)可負(fù)(阻遏) 。 類別

2、：基本轉(zhuǎn)錄因子、上游轉(zhuǎn)錄因子和可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 啟動子(Promoter) 概念：啟動子是基因序列中決定轉(zhuǎn)錄起始的部位。包括核心啟動子和上游啟動子元件 。 一個基因可同時擁有一個及以上啟動子； 一般在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游, 位于(+1)及5端上游100200b左右，是決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元素。 ； 可與增強(qiáng)子共同控制轉(zhuǎn)錄起始和強(qiáng)度； 發(fā)揮功能時除需RNA聚合酶外，還需轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用。 2.上游啟動子元件 包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)更遠(yuǎn)的上游元件。 與TFD結(jié)合成復(fù)合物后提高轉(zhuǎn)錄頻率。啟動子的研究方法研究內(nèi)容：1、 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定2、啟

3、動子區(qū)域（順式作用元件）的確定3、轉(zhuǎn)錄因子（反式作用元件）結(jié)合位點(diǎn)的確定4、反式作用元件和順式作用元件相互作用對基因轉(zhuǎn)錄的影響1、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的確定生物信息學(xué)預(yù)測TSS5-RACE初步確定TSS的大概位置引物延伸、核酸酶保護(hù)或S1作圖精確定位TSS預(yù)測CpG島常用軟件：CpGPlot （ http:/www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot ）/FirstChoice RLM-RACE Kit (Ambion)GeneRacer RLM-RACE Kit (Invitrogen )Primer extension(引物延伸)S1 nuclease mappingRNA

4、 5DNA 3*53RNA 5DNA 353PAGE AnalysisAdd S1 nucleasePrimer extension and S1 nuclease digestion2、啟動子區(qū)域的確定生物信息學(xué)預(yù)測啟動子區(qū)域缺失突變 熒光素酶活性分析克隆5 -flanking sequence并連接到報告基因載體上確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域（啟動子區(qū)域）Deletion mutagenesis(缺失誘變)Reporter vector3、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的確定(1)生物信息學(xué)預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(2)實驗證實轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：EMSA/gel-shift, super shiftChIPDNase

5、I footprinting Search for evolutionary conserved transcription factor binding sites. rVista 2.0 (/)ConSite (http:/consite. )Gel retardation(凝膠阻滯)/electrophoretic mobility shift assay (EMSA, 電泳遷移率變動分析) ChIP（染色質(zhì)免疫共沉淀）4、反式元件與順式元件的相互作用對轉(zhuǎn)錄的影響（1）定點(diǎn)突變熒光素酶活性分析（2）過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子測定目的基因的表達(dá)（3）干擾轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)測定目的基因的表達(dá)（4）轉(zhuǎn)基因動物

6、定點(diǎn)突變增強(qiáng)子（enhancer） 基因組中能增強(qiáng)鄰近基因啟動轉(zhuǎn)錄的序列。最早發(fā)現(xiàn)于SV40的基因上游，含2個72bp的正向重復(fù)序列。增強(qiáng)子特性 1.增強(qiáng)效應(yīng)非常明顯 10200倍 。 2.與其位置、取向無關(guān)（上下游、距離） 3.核心序列是重復(fù)序列,是增強(qiáng)效應(yīng)所必須 4.有細(xì)胞組織特異性， 需與特異蛋白因子作用 5.無基因特異性 6. 要有啟動子才能發(fā)揮作用Bulger and Groudine. 2002. Nature Gen. 32:555-557Models for Enhancer Action consists of several good binding sites of TF

7、s the sites are spatially clustered together the pattern of sites is conservedCharacterization of an enhancer?Enhancer Element Locator http:/www.cs.helsinki.fi/u/palin/EEL/ Assays for EnhancersTransient transfectionDNAase I hypersensitivityDNAase I footprinting/mutation analysisTransgenic miceTransi

8、ent Transfection:PLuciferaseEPLuciferaseEPLuciferase Insulator (絕緣子) 一種負(fù)調(diào)控元件，參與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。干擾增強(qiáng)子與啟動子的相互作用，并抑制啟動子的激活活性。3.7Insulator function in ImprintingTwo linked Imprinted Genes:Maternal H19 (on), Igf2 (off) Paternal H19 (off), Igf2 (on)H19Igf2Effects of insulators on enhancerpromoter interactionsCTC

9、FBSDB: a CTCF binding site database for characterization of vertebrate genomic insulators : /CTCF is the only protein identified so far in vertebrate that binds to insulators and shows enhancer-blocking activity CTCF vs. BORISCTCF11個與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域 與絕大多數(shù)的ICRs以及CpG島結(jié)合 結(jié)合是甲基化敏感的具有絕緣子功能具有邊界元素的功能，例如阻斷異染色質(zhì)的傳播 保護(hù)相應(yīng)區(qū)域不被甲基化廣泛表