丙二醛含量測定講解學習

丙二醛含量測定精品脩料精品脩料精品資料精品資料僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝實驗六、植物組織丙二醛含量測定植物葉片在衰老過程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內源激素平衡失調等。這些指標在一定程度上反映衰老過程的變化。近來大量研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過程中，細胞內活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧的積累。活性氧積累的危害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴重時會導致植物細胞死亡?；钚匝醢ê踝杂苫?。自由基是具有未配對價電子的原子或原子團。生物體內產生的活性氧主要有超氧自由基(0-2)、羥自由基(OH-)、過氧自由基(R00?)、烷氧自由基(R0?)、過氧化氫(H202)、單線態(tài)氧(021)等。植物對活性氧產生有酶促和非酶促兩類防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶60口)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶POD和抗壞血酸過氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶，抗壞血酸(ASA)和還原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。丙二醛(MDA)是細胞膜脂過氧化作用的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷。因此，丙二醛產生數(shù)量的多少能夠代表膜脂過氧化的程度，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一個常用指標。［原理］植物組織中的丙二醛(MDA)在酸性條件下加熱可與硫代巴比妥酸(TBA)產生顯色反應，反應產物為粉紅色的3，5，5一三甲基惡唑2，4一二酮(Trimet-nine)。該物質在539nm波長下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可與其它物質反應，并在該波長處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其它物質反應的影響，在丙二醛含量測定時，同時測定600nm下的吸光度，利用539nm與600nm下的吸光度的差值計算丙二醛的含量。［材料、儀器、藥品］1．材料：植物抗逆性鑒定實驗中的四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的高溫處理和室溫對照。2．儀器：(1)分光光度計；(2)離心機；(3)水浴鍋：(4)天平；(5)研缽；(6)剪刀；(7)5ml刻度離心管；(9)刻度試管(10ml);(10)鑷子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml);(12)冰箱。3．藥品：0.05mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液；石英砂;5％三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸餾水溶解，然后定容到100ml；0.5%硫代巴比妥酸溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100ml，即為0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液。［方法］1.丙二醛的提?。喝?.5g樣品，加入2ml預冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液，加入少量石英砂，在經過冰浴的研缽內研磨成勻漿，轉移到5ml刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗也移精品資料精品資料精品脩料精品脩料僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝人離心管中，最后用緩沖液定容至5ml。在4500轉/min離心10min。上清液即為丙二醛提取液。2．丙二醛含量測定：吸取2ml的提取液于刻度試管中，加入0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml,于沸水浴上加熱10min,迅速冷卻。于4500轉/min離心10min。取上清液于532、600nm波長下，以蒸餾水為空白調透光率100%,測定吸光度。3．結果計算：(A532—A600)XV1XV丙二醛含量(nmol/g)=1.55X10-1XWXV2式中：A為吸光度；V1為反應液總量(5ml);V為提取液總量(5ml)；V2為反應液中的提取液數(shù)量(2ml)；W為植物樣品重量(0.5g);1.55X10-1為丙二醛的微摩爾吸光系數(shù)(在1升溶液中含有IWmol丙二醛時的吸光度)。4．注意事項：0.1~0.5%的三氯乙酸對MDA—TBA反應較合適，若高于此濃度，其反應液的非專一性吸收偏高；MDA—TBA顯色反應的加熱時間，最好控制沸水浴10~15min之間。時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降；(3)如用乂口人作為植物衰老指標，首先應檢驗被測試材料提取液是否能與TBA反應形成532nm處的吸收峰。否則只測定532、600nm兩處A值，計算結果與實際情況不符，測得的高A值是一個假象；在有糖類物質干擾條件下(如深度衰老時)，吸光度的增大，不再是由于脂質過氧化產物乂口人含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改變了提取液成分，不能再用532nm、600nm兩處A值計算MDA含量，可測定510、532、560nm處的A值，用A532一（A510—A560）/2的值來代表丙二醛與TBA反應液的吸光值。［實驗結果記錄］［實驗前思考題］（1）通過丙二醛含量測定能夠解決什么理論和實際問題？（2）什么時候植物會發(fā)生嚴重的膜脂過氧化作用？簡述其過氧化作用過程。（3）說明膜脂過氧化作用的對植物的效應。（4）TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？（5）提取液與TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時間又不能過長？（6）為什么要測定反應液在600nm下的吸光度？（7）在計算公式中，為什么吸光系數(shù)的單位是微摩爾，而最后的含量單位卻是毫微摩爾？（