泌尿生殖系統(tǒng)感染8聯(lián)檢檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

泌尿生殖系統(tǒng)8聯(lián)檢檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程１目的明確泌尿生殖系統(tǒng)8聯(lián)檢檢測試劑盒檢測的操作規(guī)程，指導(dǎo)檢驗(yàn)人員正確進(jìn)行基因芯片檢測。2適用范圍2.1適用于進(jìn)行泌尿生殖系統(tǒng)8聯(lián)檢的檢驗(yàn)人員。2.2適合儀器：常規(guī)基因擴(kuò)增儀、恒溫雜交箱。2.3方法原理：采用PCR和DNA雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)。2.4樣品要求：泌尿生殖道樣本。2職責(zé)實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4試劑來源《泌尿生殖系統(tǒng)8聯(lián)檢檢測試劑盒》（昆明寰基生物芯片開發(fā)有限公司）。5質(zhì)控物陰性對照來源于試劑盒6檢驗(yàn)方法6.1儀器和耗材6.1.1無菌操作臺；6.1.2基因擴(kuò)增（PCR）儀（適用0.2mlPCR薄壁管）；6.1.3取樣器（0.5-10μl、40-200μl、200-1000μl）；6.1.4臺式離心機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)12,000rpm）；6.1.5恒溫培養(yǎng)箱（可恒溫42℃）或可調(diào)42℃的保溫臺6.1.6水浴恒溫振蕩器（可恒溫25℃）；6.1.7載玻片架及玻片洗脫容器2個(gè)；6.1.8芯片激光掃描儀(AxonGenePix4000B)；6.1.9PCR擴(kuò)增所需一次性耗材。6.2檢測前準(zhǔn)備6.2.1芯片洗脫液配制（若10%SDS出現(xiàn)白色絮狀沉淀，請于42℃條件加熱至溶液透明后再使用）6.2.1.1在芯片洗脫容器中按照蒸餾水（或純化水）:20×SSC:10%SDS=100:5:1配制洗脫液Ⅰ，洗脫液配制總體積應(yīng)滿足浸沒芯片；6.2.1.2在芯片洗脫容器中按照蒸餾水（或純化水）:20×SSC:10%SDS=400:1:4配制洗脫液Ⅱ，洗脫液配制總體積應(yīng)滿足浸沒芯片；6.2.1.3洗脫液一次配制可連續(xù)使用15天，每個(gè)試劑盒中提供的洗脫液在一個(gè)月內(nèi)用完。6.3樣本處理6.3.1向采樣管中加入1ml無菌生理氯化鈉，充分震蕩混勻，擠干棉拭子；6.3.2將全部液體轉(zhuǎn)移至無菌1.5ml離心管中，12,000rpm離心5min；6.3.3棄上清，沉淀中加入無菌生理氯化鈉1ml混勻，12,000rpm離心5min；6.3.4棄上清，沉淀中加入100μlDNA提取液，震蕩混勻后100℃恒溫處理10min（誤差不超過1min）；6.3.5震蕩混勻后12,000rpm離心5min，上清液為臨床樣本DNA；6.3.6取5μl陰性性參考品，加入50μlDNA提取液，震蕩混勻后100℃恒溫處理10min（誤差不超過1min），震蕩混勻后12,000rpm離心5min，上清液為參考品DNA。6.4PCR擴(kuò)增及標(biāo)記HPV檢測按下表配制擴(kuò)增-標(biāo)記反應(yīng)體系，按其循環(huán)參數(shù)在0.2mlPCR薄壁管中進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記。反應(yīng)體系循環(huán)參數(shù)組份加量（μl）95℃5min×1cycle;(94℃20s，57℃20s，65℃30s)×30cycles;(94℃20s,72℃30s)×5cycles;72℃5min×1cycle;95℃5min×1cycle.臨床樣本DNA或陰性參考品5.0PCR擴(kuò)增試劑混合物12.5PCR擴(kuò)增引物混合物7.5總體積25.06.5雜交6.5.1將恒溫臺或雜交箱開啟升溫恒定到42℃，用雜交模塊將洗片固定好，預(yù)熱10min。6.5.2將PCR產(chǎn)物加熱至95℃（置于PCR儀中）變性5min,PCR產(chǎn)物變性完畢取出后，立即冰浴3min。6.5.3取75μl經(jīng)50℃預(yù)熱的雜交緩沖液和25μl臨床樣本擴(kuò)增-標(biāo)記產(chǎn)物充分混勻，將混合物全部滴加在芯片矩陣位置，（操作過程中禁止觸碰到微陣列區(qū)，避免產(chǎn)生氣泡）；6.5.4將保濕雜交盒水平放入42℃，恒溫臺上或恒溫箱內(nèi)雜交40min。6.6洗脫將芯片放入洗脫容器中，在25℃恒溫水浴搖床100rpm震蕩條件下進(jìn)行洗脫。洗脫流程：洗脫液Ⅰ，5min；洗脫液Ⅱ，5min。洗脫完畢后，將芯片自然晾干或用專用的玻片離心機(jī)甩干即可進(jìn)行掃描。6.7掃描及結(jié)果判定6.7.1將干燥后的芯片置于激光掃描儀中使用532nm波長激光掃描（按說明書操作），獲得掃描數(shù)據(jù)及圖譜；6.7.2按照說明書要求對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，生成檢測報(bào)告（為簡化操作，數(shù)據(jù)判讀可采用數(shù)據(jù)輔助分析軟件進(jìn)行）?！緟⒖贾怠?判定值7.1.1芯片探針布局如圖2所示，其中P為定位點(diǎn)，buffer為空白點(diǎn)，NC為陰性參考點(diǎn)，PC為陽性參考點(diǎn)，IC為提取對照點(diǎn)，HC為雜交對照點(diǎn)，6為人乳頭狀瘤病毒6亞型的檢測探針；11為人乳頭狀瘤病毒11亞型的檢測探針；16為人乳頭狀瘤病毒16亞型的檢測探針等；7.1.2對于任意位點(diǎn)，其熒光值（熒光前景值-熒光背景值）≥2倍熒光背景值，判斷該位點(diǎn)為“陽性”，否則該位點(diǎn)判斷為“陰性”。注：數(shù)據(jù)分析時(shí)，熒光值數(shù)據(jù)采用其“中值”進(jìn)行計(jì)算POSbuffer61116182631323334PCPOSbuffer61116182631323334PCPOSbuffer61116182631323334PCPOSbuffer61116182631323334PC353940424344455152535455353940424344455152535455353940424344455152535455353940424344455152535455IC56575859616266686970NCIC56575859616266686970NCIC56575859616266686970NCIC56575859616266686970NC717273818282/IS39838489bufferCTMG717273818282/IS39838489bufferCTMG717273818282/IS39838489bufferCTMG717273818282/IS39838489bufferCTMGHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOSHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOSHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOSHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOS圖2.芯片探針布局7.2結(jié)果判讀步驟7.2.1判斷對照探針PC：若其4個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中，滿足“陽性”的位點(diǎn)數(shù)≥3，則繼續(xù)進(jìn)行第2.2步判讀，否則判讀結(jié)果為“失敗”；7.2.2判斷對照探針NC：若其4個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中，滿足“陰性”的位點(diǎn)數(shù)≥3，則繼續(xù)進(jìn)行第2.3步判讀，否則判讀結(jié)果為“失敗”；7.2.3判斷對照探針HC：若其4個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中，滿足“陽性”的位點(diǎn)數(shù)≥3，則繼續(xù)進(jìn)行第2.4步判讀，否則判讀結(jié)果為“失敗”；7.2.4判斷對照探針I(yè)C：若其4個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中，滿足“陽性”的位點(diǎn)數(shù)≥3，則判斷對照探針I(yè)C為“陽性”，否則判斷對照探針I(yè)C為“陰性”7.2.5判斷病原體檢測探針：例如，人乳頭狀瘤病毒6亞型檢測探針6：若6探針的4個(gè)重復(fù)位點(diǎn)滿足“陽性”的位點(diǎn)數(shù)≥3，則判為人乳頭狀瘤病毒6亞型檢測結(jié)果為“陽性”；若某個(gè)探針的4個(gè)重復(fù)位點(diǎn)滿足“陰性”的位點(diǎn)數(shù)≥3，則判該檢測探針為“陰性”7.2.6重復(fù)第5步操作，對其它亞型等掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行判讀；7.2.7整理判讀結(jié)果，生成檢測報(bào)告。8【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】8.1對陽性參考點(diǎn)PC不滿足要求引起的判讀“失敗”，原因?yàn)閿U(kuò)增體系出現(xiàn)問題；8.2對陽性參考點(diǎn)HC不滿足要求引起的判讀“失敗”，原因?yàn)殡s交體系出現(xiàn)問題8.3對照探針I(yè)C判讀為“陽性”，表明取樣時(shí)取到人體脫落細(xì)胞；該探針判讀為“陰性”，表明取樣時(shí)未取到人體脫落細(xì)胞。若對照探針I(yè)C判讀結(jié)果為“陰性”，且所有病原體檢測探針均為“陰性”結(jié)果，建議重新取樣檢測。8.4陰性參考品檢測反應(yīng)中，若芯片判讀結(jié)果出現(xiàn)某病原體探針“陽性”結(jié)果，則表示該次檢測體系存在該探針污染。8.5陽性參考品檢測反應(yīng)中，若芯片判讀結(jié)果出現(xiàn)某病原體探針“陰性”結(jié)果，則表示該次檢測體系中該探針或?qū)?yīng)檢測反應(yīng)失效?！緳z驗(yàn)方法的局限性】檢測結(jié)果僅表示樣本中是否有病原體DNA，不能區(qū)分活性病原體與非活性病原體。【產(chǎn)品性能指標(biāo)】1本試劑盒可同時(shí)檢測臨床樣本中人乳頭狀瘤病毒40種亞型，。2檢測靈敏度：25基因拷貝/PCR反應(yīng)管。3本試劑盒淋球菌檢測探針與以下奈瑟菌屬的其他奈瑟氏菌不存在交叉反應(yīng)：腦膜炎奈瑟氏菌3株、微黃色奈瑟氏菌、乳糖奈瑟氏菌、深黃色奈瑟氏菌、灰色奈瑟氏菌、粘膜奈瑟氏菌、長型奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌?！咀⒁馐马?xiàng)】1本產(chǎn)品僅用于體外診斷，為一次性使用產(chǎn)品。2標(biāo)本采集不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果錯(cuò)誤。3實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR基因擴(kuò)增試驗(yàn)室的管理規(guī)范，操作人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)。4試劑使用前必須完全解凍，使用過程中應(yīng)避免反復(fù)凍融。5在檢測全程操作中，應(yīng)遵循處理傳染性物質(zhì)和化學(xué)試劑操作的通用規(guī)范