核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析-王偉課件

核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析C組王偉2012.7.27

核酸是遺傳信息的載體，包括DNA和RNA,是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。核酸的分離與純化核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子分開(kāi)。在分離核酸時(shí)，應(yīng)遵循兩個(gè)原則：一是保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，因?yàn)橥暾囊患?jí)結(jié)構(gòu)是核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的最基本的要求；二是盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度。核酸分離與純化的過(guò)程一般都包括了材料的選擇、核酸的釋放、核酸與其它生物大分子的分離、核酸的純化與鑒定、核酸的濃縮、保存等幾個(gè)主要步驟。二：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及對(duì)策

一：DNA提取方法簡(jiǎn)介

樣本保存和前處理

核酸分離與純化的步驟DNA提取的基本步驟樣本裂解純化去蛋白沉淀核酸洗滌去鹽溶解DNA沉淀樣本裂解；純化去蛋白蛋白的去除：采用蛋白酶K進(jìn)行處理；裂解液和蛋白酶Ｋ混勻后立即使用，加入裂解液和蛋白酶K的混合液后立即渦旋混勻保證水浴時(shí)間，使樣本充分混勻。當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分。沉淀后應(yīng)用70％乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）樣本保存和前處理抗凝血液非抗凝血

微量血液/干血點(diǎn)口拭子/漱口水樣本保存和前處理－抗凝血液

保存:檸檬酸、EDTA、肝素三種抗凝劑均可使用。但肝素對(duì)酶反應(yīng)有可能起阻害作用,采血時(shí)如沒(méi)有特殊要求,使用檸檬酸或EDTA處理血樣。加入抗凝劑混勻后2-8℃保存一周；－20℃保存一個(gè)月；－70℃長(zhǎng)期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融！樣本前處理:1.凍存的抗凝血液使用前溶解應(yīng)在37℃水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要徹底混勻后再吸取實(shí)驗(yàn)所需的體積。樣本保存和前處理－微量血液/血斑

保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；干血點(diǎn)：干燥后室溫或4℃保存；樣本前處理1.微量血液處理同抗凝血液，不同之處是無(wú)需進(jìn)行紅細(xì)胞裂解步驟。2.血斑加入緩沖液直接進(jìn)行提取。核酸分離與純化的步驟

裂解紅細(xì)胞核酸的釋放基因組DNA的分離純化核酸的收集與保存測(cè)定結(jié)果分析核酸分離與純化的步驟

裂解紅細(xì)胞核酸的釋放基因組DNA的分離純化核酸的收集與保存測(cè)定結(jié)果分析核酸的釋放（一）機(jī)械法包括低超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎，但機(jī)械力也可引起高分子量線(xiàn)性分子的斷裂，因而不適用于染色體DNA的分離純化。（二）酶法通過(guò)加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使細(xì)胞破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離。核酸的釋放（三）SDS法SDS（十二烷基磺酸鈉）：常用于DNA提取過(guò)程中使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開(kāi)。SDS是一種已知的能夠使蛋白質(zhì)變性的去污劑。它可以用于核酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸-蛋白復(fù)合物。在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來(lái)。同時(shí)對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用。核酸的釋放–酶法蛋白酶K：裂解包括膜蛋白的游離和與基因組DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對(duì)蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用；同時(shí)，巨大的基因組DNA是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組DNA”纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組DNA的純度更高。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。核酸的釋放–SDS法原理SDS陰離子去垢劑高溫（55～65℃）裂解細(xì)胞，蛋白變性，染色體離析，從而釋放出出核酸高鹽(KAc或NH4Ac)或降低溫度（冰?。┦沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNA核酸分離與純化的步驟

裂解紅細(xì)胞核酸的釋放基因組DNA的分離純化核酸的收集與保存測(cè)定結(jié)果分析基因組DNA的分離純化一、有機(jī)沉淀劑二、介質(zhì)純化方法基因組DNA的分離純化–有機(jī)沉淀劑

（2）異丙醇原理：異丙醇比較疏水，能夠奪取核酸周?chē)乃?，因此核酸能夠聚集而發(fā)生沉淀。但一般要先加入NaCl/NaAc，沉淀前核酸一般帶負(fù)電，鈉離子與之中和，因此消除同性電荷的相斥，更易沉淀核酸。優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類(lèi)、蔗糖與DNA共沉淀，異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次?；蚪MDNA的分離純化–介質(zhì)介質(zhì)：是一個(gè)越來(lái)越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊戄^小，分離出的純度高，比較穩(wěn)定基因組DNA的分離純化–介質(zhì)磁珠法磁珠法核酸純化技術(shù)采用了納米級(jí)磁珠微珠，這種磁珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，能同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。硅磁就是指磁珠微珠表面包裹一層硅材料，來(lái)吸附核酸，其純化原理類(lèi)型于玻璃珠的純化方式。離心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一層可發(fā)生離心交換的材料（如DEAE，COOH）等，從而達(dá)到吸附核酸目的。不同性質(zhì)的磁珠微珠所對(duì)應(yīng)的純化原理是不一致。使用磁珠法來(lái)純化核酸的最大優(yōu)點(diǎn)就是自動(dòng)化。磁珠在磁場(chǎng)條件下可以發(fā)生聚集或分散，從而可徹底擺脫離心等所需的手工操作流程。核酸分離與純化的步驟

裂解紅細(xì)胞核酸的釋放基因組DNA的分離純化核酸的收集與保存測(cè)定結(jié)果分析核酸的收集與保存核酸的溶解和保存:純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解。DNA則多以弱堿性的Tris或者TE溶解。經(jīng)典的DNA溶解方法多提倡使用TE溶解，認(rèn)為EDTA可以減少DNA被可能殘留下來(lái)的脫氧核糖核酸酶降解。降解的風(fēng)險(xiǎn)：如果操作過(guò)程控制得，完全可以直接使用Tris或者水(pH接近7)溶解DNA。基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與濃度成正比而與溫度成反比。如果溫度合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的pH值不合適導(dǎo)致的水解(DNA在弱堿性更合適)。DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題DNA中含有蛋白、多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。原因?qū)Σ逥NA提取常見(jiàn)問(wèn)題材料不新鮮、反復(fù)凍融或細(xì)胞衰老凍融或細(xì)胞衰老提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染盡量取新鮮材料，低溫保存避免反復(fù)凍融可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌DNA分裝保存于緩沖液，避免反復(fù)