組織培養(yǎng) 整理

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1.1植物組織培養(yǎng)的一般概念廣義的組織培養(yǎng)，不僅包括在無菌條件下利用人工培養(yǎng)基對植物組織的培養(yǎng)，而且包括對原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞和植物器官的培養(yǎng)。Gamborg曾根據(jù)所培養(yǎng)的植物材料的不同，把組織培養(yǎng)分為5種類型，即愈傷組織培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)(胚、花藥、子房、根和莖的培養(yǎng)等)、莖尖分生組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。其中愈傷組織培養(yǎng)是一種最常見的培養(yǎng)形式。1.1植物組織培養(yǎng)的一般概念所謂愈傷組織，原是指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞，在組織培養(yǎng)中，則指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無序生長的薄壁細(xì)胞。愈傷組織培養(yǎng)所以是一種最常見的培養(yǎng)形式，是因?yàn)槌o尖分生組織培養(yǎng)和一部分器官培養(yǎng)以外，其他幾種培養(yǎng)形式最終也都要經(jīng)歷愈傷組織才能產(chǎn)生再生植株，此外，愈傷組織還常常是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和原生質(zhì)體的來源在組織培養(yǎng)中，當(dāng)我們把分化組織中的不分裂的靜止細(xì)胞，放在一種能促進(jìn)細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基上以后，細(xì)胞內(nèi)就會(huì)發(fā)生某些變化，從而使細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)。一個(gè)成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程叫做脫分化。在組織培養(yǎng)中，我們把由活植物體上切取下來以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體一個(gè)成熟的植物細(xì)胞經(jīng)歷了脫分化后之所以還能再分化而形成完整的植株，是因?yàn)檫@些細(xì)胞具有全能性。所謂全能性，就是說，任何具有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息。對已分化的細(xì)胞的全能性的實(shí)驗(yàn)研究表明，至少在某些情況下，發(fā)育和分化過程并不導(dǎo)致細(xì)胞中遺傳信息的丟失或不可逆的鈍化，所涉及的只是這些遺傳信息表達(dá)調(diào)控機(jī)制的改變。有關(guān)全能性的肯定實(shí)驗(yàn)證據(jù)是Steward等人(1958)在以胡蘿卜根組織為外植體的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中得到的。當(dāng)他們把栽培胡蘿卜次生韌皮部薄片培養(yǎng)在一種含有椰子汁的固體培養(yǎng)基上時(shí)，產(chǎn)生了由簡單的薄壁細(xì)胞組成的愈傷組織。把這些愈傷組織轉(zhuǎn)入到成分相同的液體培養(yǎng)基中并不斷振蕩，又產(chǎn)生了由單個(gè)細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成的懸浮液。全能性只是一種可能性，由以上的介紹我們可以看到，要把這種可能性變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)性必須滿足兩個(gè)條件：一是要把這些細(xì)胞從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來，也就是說必須使這部分細(xì)胞處于離體的條件下，二是要給予它們適當(dāng)?shù)拇碳ぃ唇o予它們一定的營養(yǎng)物質(zhì)，并使它們受到一定的激素的作用。一個(gè)已分化的細(xì)胞要表現(xiàn)它的全能性，必須經(jīng)歷上面所說的兩個(gè)過程，即首先要經(jīng)歷脫分化過程，然后再經(jīng)歷再分化過程。脫分化是指植物在組織培養(yǎng)時(shí)，在激素調(diào)節(jié)下由成熟組織的細(xì)胞（如葉細(xì)胞）轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程。再分化是指在植物組織培養(yǎng)過程中，分生狀態(tài)的細(xì)胞在激素的作用下分化轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒旖M織或器官的過程。脫分化后的細(xì)胞進(jìn)行再分化的過程有兩種不同的方式，一種是器官發(fā)生方式，其中莖芽和根是在愈傷組織的不同部位分別獨(dú)立形成的，形成的時(shí)間可能也不一致，它們?yōu)閱螛O性結(jié)構(gòu)，里面各有維管束與愈傷組織相連，但在不定芽和不定根之間并沒有共同的維管束把二者連在一起，另一種是胚胎發(fā)生方式，即在愈傷組織表面或內(nèi)部形成很多胚狀體，或稱體細(xì)胞胚，它們經(jīng)歷的發(fā)育階段與合子胚相似，成熟胚狀體的結(jié)構(gòu)也與合子胚相同。胚狀體是雙極性的，有共同的維管束貫穿兩極，可脫離愈傷組織在無激素培養(yǎng)基上獨(dú)立萌發(fā)。一般認(rèn)為，愈傷組織中的不定芽起源于一個(gè)以上的細(xì)胞，而體細(xì)胞胚只起源于一個(gè)細(xì)胞，因此由體細(xì)胞胚長成的植株各部分的遺傳組成應(yīng)當(dāng)是一致的，不存在嵌合現(xiàn)象，不過也有些作者在這類再生植株中同樣發(fā)現(xiàn)了嵌合現(xiàn)象，因此認(rèn)為體細(xì)胞胚也起源于一個(gè)以上的細(xì)胞。胚狀體：在愈傷組織形成以后，培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)中開始形成結(jié)構(gòu)緊實(shí)，解剖結(jié)構(gòu)類似于胚的單細(xì)胞來源的培養(yǎng)物。我們稱之為胚狀體。在很多植物中，胚狀體的結(jié)構(gòu)都是相當(dāng)?shù)湫偷模谟行┲参锶缧←溨?，幼齡胚狀體的盾片往往變大變綠，形成通常所描述的“葉狀結(jié)構(gòu)”，并且常常出觀早熟萌發(fā)的現(xiàn)象。胚狀體與不定芽的區(qū)別①最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。②胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。③胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“v”字形，而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象胚狀體與合子胚的比較

合子胚胚狀體質(zhì)量萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率低，質(zhì)量差來源受精卵體細(xì)胞胚柄有，明顯即使有也不明顯形態(tài)固定，體積相對較小復(fù)雜，常有兩個(gè)以上的子葉體積相對較大變異率低高通過胚狀體途徑產(chǎn)生再生植株有3個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)，首先，在一個(gè)培養(yǎng)物上所能產(chǎn)生的胚狀體數(shù)目往往比不定芽的數(shù)目多(例如在一個(gè)離體培養(yǎng)的煙草花藥上可以產(chǎn)生200個(gè)以上的胚狀體);其次，胚狀體形成的速度快，第三，胚狀體結(jié)構(gòu)完整，一旦形成，一般都可直接萌發(fā)形成小植株，因此成苗率較高。1．2植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史雖然組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃發(fā)展只是近五十年來的事，但它的整個(gè)歷史可以追溯到十九世紀(jì)末和二十世紀(jì)初。從那時(shí)起到現(xiàn)在，組織培養(yǎng)的發(fā)展過程大致可以分為三個(gè)階段：本世紀(jì)初，在Schleiden和Schwann所發(fā)展起來的細(xì)胞學(xué)說的推動(dòng)下，德國植物生理學(xué)家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn)。為了論證這一觀點(diǎn)，他在加入了蔗糖的Knop溶液中培養(yǎng)單個(gè)離體細(xì)胞，所選用的材料是小野芝麻和鳳眼蘭的柵欄組織和虎眼萬年青屬植物的表皮細(xì)胞等。遺憾的是，雖然在柵欄細(xì)胞中他明顯看到了細(xì)胞的生長、細(xì)胞壁的加厚和淀粉的形成等，但沒有一個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)中能夠發(fā)生分裂。Haberlandt實(shí)驗(yàn)失敗的原因，現(xiàn)在看來主要在于兩點(diǎn)：第一，他所選用的實(shí)驗(yàn)材料都是已經(jīng)高度分化了的細(xì)胞，第二，所用的培養(yǎng)基過于簡單，特別是培養(yǎng)基中沒有包含誘導(dǎo)成熟細(xì)胞分裂所必需的生長激素，這是因?yàn)樯L激素在當(dāng)時(shí)還沒有發(fā)現(xiàn)。然而，做為植物組織培養(yǎng)的先驅(qū)者，Haberlandt的貢獻(xiàn)不僅在于首次進(jìn)行了離體細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，而且在其1902年發(fā)表的“植物離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)”的報(bào)告中，還提出了胚囊液在組織培養(yǎng)中的作用和看護(hù)培養(yǎng)法等科學(xué)的預(yù)見。自Haberlandt的實(shí)驗(yàn)之后，直到1934年White培養(yǎng)番茄離體根尖的成功，在其間的32年時(shí)間里，植物組織培養(yǎng)技術(shù)幾乎沒有什么進(jìn)展，只是在以下兩個(gè)方面進(jìn)行了一些初步的探索。Laibach(1925，1929)把由亞麻種間雜交形成的不能成活的種子中的胚剖出，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)至成熟，從而證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)緣雜交中利用的可能性；到了30年代中期，植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域里出現(xiàn)了兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，其一是，認(rèn)識(shí)了B族維生素對植物生長的重要意義，二是發(fā)現(xiàn)了生長素是一種天然的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。導(dǎo)致這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的主要是White和Gautheret的實(shí)驗(yàn)。1934年，White由番茄根建立了第一個(gè)活躍生長的無性系，使根的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)首次獲得了真正的成功。起初，他在實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基包含無機(jī)鹽、酵母浸出液和蔗糖。后來(1937)，他用3種B族維生素，即吡哆醇，硫胺素和煙酸，取代酵母浸出液獲得成功。在這個(gè)以后被稱為White培養(yǎng)基的合成培養(yǎng)基上，他把某些于1934年建立起來的根培養(yǎng)物一直保存到1968年他逝世前不久。與此同時(shí)，Gautheret(1934)在山毛柳和黑楊等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，雖然在含有葡萄糖和鹽酸半胱氨酸的Knop溶液中，這些組織也可以不斷增殖幾個(gè)月，但只有在培養(yǎng)基中加入了B族維生素和IAA以后，山毛柳形成層組織的生長才能顯著增加.由于這些實(shí)驗(yàn)揭示了B族維生素和生長素的重要意義，又直接導(dǎo)致了1939年Gautheret連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜，也建立了類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。因此，Gautheret，White和Nobecourt一起被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。40年代和50年代初期，活躍在植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域里的研究者以Skoog為代表，研究的主要內(nèi)容是利用嘌呤類物質(zhì)處理煙草髓愈傷組織以控制組織的生長和芽的形成。Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷不但可以促進(jìn)愈傷組織的生長，而且還能解除培養(yǎng)基中生長素(IAA)對芽形成的抑制作用，誘導(dǎo)芽的形成，從而確定了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致了激動(dòng)素的發(fā)現(xiàn)和以后利用激動(dòng)素和生長素在組織培養(yǎng)中控制器官分化工作的開展。在40年代，組織培養(yǎng)技術(shù)的另一項(xiàng)發(fā)展是Overbeek等(1941)首次把椰子汁做為補(bǔ)加物引入到培養(yǎng)基中，使曼陀羅的心形期幼胚能夠離體培養(yǎng)至成熟。到50年代初，由于Steward等在胡蘿卜組織培養(yǎng)中也使用了這一物質(zhì)，從而使椰子汁在組織培養(yǎng)的各個(gè)領(lǐng)域中都得到了廣泛應(yīng)用。50年代開始以后，植物組織培養(yǎng)的研究日趨繁榮，10年當(dāng)中引入注目的進(jìn)展就有以下6項(xiàng)：1952年，Morel和Martin首次證實(shí)，通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無毒植株1953～1954年，Muir進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。方法是把萬壽菊(Tageteserecta)和煙草的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，放在搖床上振蕩，使組織破碎，形成由單細(xì)胞和細(xì)胞聚集體組成的細(xì)胞懸浮液，然后通過繼代培養(yǎng)進(jìn)行繁殖。Muir等還用機(jī)械方法由細(xì)胞懸浮液和容易散碎的愈傷組織中分離得到單細(xì)胞，把它們置于一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細(xì)胞發(fā)生了分裂。這種“看護(hù)培養(yǎng)”技術(shù)揭示了實(shí)現(xiàn)Haberlandt培養(yǎng)單細(xì)胞這一設(shè)想的可能性。1955年，Milier等由鯡魚精子DNA中分離出一種首次為人所知的細(xì)胞分裂素，并把它定名為激動(dòng)素(kinetin)?，F(xiàn)在，具有和激動(dòng)素類似活性的合成的或天然的化合物已有多種，它們總稱為細(xì)胞分裂素(cytokinin)。應(yīng)用這類物質(zhì)，我們就有可能誘導(dǎo)已經(jīng)成熟和高度分化的組織(如葉肉和干種子胚乳)的細(xì)胞進(jìn)行分裂。1957年，Skoog和Miller提出了有關(guān)植物激素控制器官形成的概念，指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長素對細(xì)胞分裂素比率的函數(shù)，通過改變培養(yǎng)基中這兩類生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的相對濃度可以控制器官的分化：這一比率高時(shí)促進(jìn)生根，低時(shí)促進(jìn)莖芽的分化，二者濃度相等時(shí)，組織則傾向于以一種無結(jié)構(gòu)的方式生長1958年，Wickson和Thimann指出，應(yīng)用外源細(xì)胞分裂素可促成在頂芽存在的。后來，Murashige發(fā)展了這一方法，制訂了一系列標(biāo)準(zhǔn)程序，把這一方法廣泛用于由蕨類植物到花卉和果樹的快速繁殖上。1958～1959年，Reinert和Steward分別報(bào)道，在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細(xì)胞胚。這是一種不同于通過芽和根的分化而形成植株的再生方式。現(xiàn)在知道有很多物種都能形成體細(xì)胞胚。在有些植物如胡蘿卜和毛茛中，事實(shí)上由植物體的任何部分都可以得到體細(xì)胞胚。60年代以來組織培養(yǎng)技術(shù)所以得到了迅速發(fā)展，一方面是由于有了前60年建立的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，另一方面是由于這項(xiàng)技術(shù)開始走出了植物學(xué)家和植物生理學(xué)家的實(shí)驗(yàn)室，通過與常規(guī)育種、良種繁育和遺傳工程技術(shù)相結(jié)合，在植物改良中發(fā)揮了重要的作用，并且在若干方面已經(jīng)取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。60年代以來組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，概括起來可以分為三個(gè)方面：(1)原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功，大大激發(fā)了人們對原生質(zhì)體培養(yǎng)的熱情。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不但在理論上證明了除體細(xì)胞和生殖細(xì)胞以外，無壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實(shí)踐上可以為外源基因的導(dǎo)入提供理想的受體材在1985年以前，作為糧食和飼料主要來源的禾谷類植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)鮮有突破，只是最近幾年間，水稻、玉米、小麥、高梁、谷子和大麥等的原生質(zhì)體培養(yǎng)才相繼告捷。在這方面，中國學(xué)者做出了重要貢獻(xiàn)。原生質(zhì)體培養(yǎng)的成功，促進(jìn)了體細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展。(2)花藥培養(yǎng)取得顯著成績1964年，Guha和Maheshwari報(bào)道，在南洋金花中通過離體花藥培養(yǎng)由小孢子直接發(fā)育成胚。1967年，Bourgin和Nitsch通過花藥培養(yǎng)獲得了完整的煙草植株。由于單倍體在突變選擇和加速雜合體純合化過程中的重要作用，這一領(lǐng)域的研究在整個(gè)70年代得到了迅速發(fā)展，獲得成功的物種數(shù)目增加到160余種，其中包括很多種重要的栽培植物。煙草、水稻和小麥等的花培育種在中國取得了引人注目的成就。(3)微繁技術(shù)得到廣泛應(yīng)用1960年，Morel提出了一個(gè)離體無性繁殖蘭花的方法，繁殖系數(shù)極高。由于這一方法有巨大的實(shí)用價(jià)值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起“蘭花工業(yè)”，目前，用這種方法繁殖的蘭花至少已有35個(gè)屬150余種。除蘭花外，在其他很多觀賞植物和經(jīng)濟(jì)作物(如甘蔗和草莓等)中，微繁也已達(dá)到了工廠化的生產(chǎn)規(guī)模，在若干作物中與通過莖尖培養(yǎng)進(jìn)行脫毒相結(jié)合，產(chǎn)生了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。1．3組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系組織培養(yǎng)一方面可為遺傳工程提供理想的受體材料，另一方面又可為常規(guī)的植物改良程序提供一種新的手段，從而使很多用傳統(tǒng)方法難以解決的問題迎刃而解，更多更快更好地創(chuàng)造出各種農(nóng)作物和園藝植物的新品種、新類型和新種質(zhì)。例如：——在自花授扮作物雜交育種中，或在異花授粉作物自交系選育過程中，采用花藥培養(yǎng)技術(shù)不但可縮短雜合體純合化所需的時(shí)間，而且還可以節(jié)省土地面積，假定兩個(gè)雜交親本在n個(gè)獨(dú)立遺傳的位點(diǎn)上彼此不同，通過花藥培養(yǎng)，在理論上只要有2n個(gè)F1代花粉植株，就有可能得到一個(gè)所需要的基因組合，而利用傳統(tǒng)育種方法，則至少要有4n個(gè)F2植株才能得到這樣一個(gè)組合?！谶h(yuǎn)緣雜交中，通過離體授粉或原生質(zhì)體融合有可能克服受精前障礙，通過幼齡合子胚培養(yǎng)可以克服受精后障礙，通過體細(xì)胞融合還有可能制造出細(xì)胞質(zhì)雜種?！獙τ跓o藥可治的病毒病，可通過莖尖培養(yǎng)消除病毒，這對解決馬鈴薯種薯退化問題能發(fā)揮重要作用，在其它很多植物中也可用以建立無毒原種。——通過離體誘導(dǎo)不定芽或促進(jìn)腋芽生枝，可對很多重要的園藝植物和名貴花卉、樹種進(jìn)行快速繁殖。——應(yīng)用在細(xì)胞水平上進(jìn)行突變體選擇的技術(shù)，可以在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而大大提高選擇效率，節(jié)省時(shí)間和土地面積，并且不受季節(jié)的限制。——體細(xì)胞無性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三個(gè)變異來源，這種變異在育種中的利用價(jià)值已經(jīng)引起人們的廣泛注意。——通過用人工種皮包被體細(xì)胞胚制造人工種子，為某些稀有和珍貴物種的繁殖提供了一種高效的手段。利用藥用植物進(jìn)行組織培養(yǎng)，生產(chǎn)有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。如人參，三七中的藥用成分（皂苷）可以大量生產(chǎn)?！貏e是在無性繁殖植物中，通過對莖尖分生組織等離體材料進(jìn)行超低溫保存，不但可以大大節(jié)省空間，而且還不致受到病蟲害的侵襲，并便于無毒種質(zhì)的國際交換。2．1引言一個(gè)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的面積大小和裝備程度取決于兩個(gè)因素：一是所要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)，二是所能得到的經(jīng)費(fèi)的多少。然而，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)具備的設(shè)施：①玻璃器皿、塑料器皿和其他實(shí)驗(yàn)器皿的清洗和貯存；②培養(yǎng)基的制備、滅菌和貯存；③植物材料的無菌操作④將培養(yǎng)物保持在溫度、光照、可能時(shí)還有濕度的可控條件下；⑤培養(yǎng)物的觀察。為此至少需要有兩個(gè)隔開的房間：一間用于玻璃器皿的清洗和貯存，以及培養(yǎng)基的制備(培養(yǎng)基室)，第二間用于放置培養(yǎng)物(培養(yǎng)室)。培養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)放一張桌子，上置雙筒解剖鏡和所需的光源，以便對培養(yǎng)物進(jìn)行鏡檢。2．2．1培養(yǎng)基室配制培養(yǎng)基所需的一般設(shè)備包括：①工作臺(tái)——其高度應(yīng)適合于站著工作，②低溫冰箱——用以貯存貯備液和椰子汁等，若無低溫冰箱，在普通冰箱內(nèi)也可短期貯存，③普通冰箱——用以貯存各種化學(xué)藥品、植物材料，和短期貯存貯備液等；④大塑料瓶——用以貯存蒸餾水；⑤天平；⑥電熱磁攪拌器——用以溶解化學(xué)藥品⑦酸度計(jì)⑧吸氣機(jī)或真空泵——用以輔助過濾滅菌；⑨恒溫水浴鍋——用以融化瓊脂，⑩高壓滅菌鍋或家用壓力鍋——用以進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌2．2．2培養(yǎng)容器各種不同類型的容器都可用來培養(yǎng)植物材料。玻璃試管廣口玻璃瓶牛奶瓶和罐頭瓶塑料容器耐高溫高壓的透明塑料封口，橡皮圈箍扎2．2．3培養(yǎng)室培養(yǎng)室的溫度應(yīng)當(dāng)是可控的，一般是用空調(diào)或熱風(fēng)機(jī)使溫度保持在25±2℃培養(yǎng)一般是在散射光下進(jìn)行的，但有些情況下也需要較強(qiáng)的光照或完全黑暗，設(shè)備上對此應(yīng)當(dāng)有所準(zhǔn)備。當(dāng)培養(yǎng)室的相對濕度降到50％以下時(shí)，應(yīng)采取措施增加濕度。一般應(yīng)75%相對濕度。進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)室內(nèi)還應(yīng)設(shè)有搖床最好設(shè)置一臺(tái)備用發(fā)電機(jī)在培養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)設(shè)有若干培養(yǎng)架以放置培養(yǎng)物，每層分別裝有日光燈管，小風(fēng)扇。2．3技術(shù)

2．3．1玻璃器皿和塑料器皿的清洗傳統(tǒng)辦法是用洗液(重鉻酸鉀和濃硫酸混合液)浸泡約4h現(xiàn)在都使用特制的洗滌劑放入高壓鍋中滅菌超聲波洗滌柜2．3．2滅菌培養(yǎng)基的污染有幾個(gè)可能的來源：1培養(yǎng)容器，2培養(yǎng)基本身，3外植體，4接種室的環(huán)境，5在接種和繼代時(shí)用以操作植物材料的器械，6培養(yǎng)室的環(huán)境。下面討論防止由這些來源造成污染的各種措施1．培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中，由培養(yǎng)基達(dá)到要求溫度的時(shí)刻算起，在1．06kg／cm2的壓力下(121℃所需的時(shí)間隨著要進(jìn)行消毒的液體的容積而變化當(dāng)冷卻被消毒的溶液時(shí)必須十分當(dāng)心，如果壓力急速下降，超過了溫度下降的速率，就會(huì)使液體滾沸，從培養(yǎng)容器中溢出。只有當(dāng)高壓滅菌鍋的壓力表指針回到零(溫度不高于50℃某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(如GA，、玉米素，ABA)，尿素以及某些維生素等，遇熱時(shí)容易分解，不能進(jìn)行高壓滅菌。熱分解化合物溶液的滅菌是通過濾膜過濾進(jìn)行的，然后再將之加入高壓滅菌過的培養(yǎng)基中在進(jìn)行溶液過濾消毒時(shí)，可使用孔徑為0．45微米或更小的細(xì)菌濾膜。過濾器的滅菌溫度非常重要，不應(yīng)超過121℃過濾滅菌的操作：把一個(gè)裝有需要滅菌的溶液的帶刻度注射器(不必消毒)安到已滅過菌的過濾器組件的一端，緩慢地推動(dòng)溶液使之穿越安在這個(gè)過濾器組件中間的細(xì)菌濾膜，過濾后的溶液由過濾器組件的另一端滴下來，直接加入培養(yǎng)基中2．玻璃器皿、塑料器皿和器械玻璃培養(yǎng)容器常常與培養(yǎng)基一起滅菌對于無菌操作所用的各種器械，如鑷子、解剖刀、解剖針和扁頭小鏟等，一般的消毒辦法是把它們先在95％酒精中浸一下，然后再置火陷上灼燒，待冷卻后使用。3．植物材料有若干種滅菌劑可用來進(jìn)行植物組織消毒，應(yīng)當(dāng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間，以盡量減少組織的死亡。一般來說，如果外植體較硬較大，容易操作，可直接用滅菌劑進(jìn)行處理。若要培養(yǎng)柔嫩的莖尖或花粉粒，須分別把莖芽或花蕾進(jìn)行表面消毒，然后在無菌條件下取出外植體。這類外植體一般都不帶污染微生物4．接種區(qū)最后必須特別強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，無論是接種還是繼代，當(dāng)培養(yǎng)容器敞著口的時(shí)候，必須從各方面注意防止任何污染物進(jìn)入容器，為此所有的操作都必須在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行。近年來多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都使用各種類型的超凈工作臺(tái)進(jìn)行無菌操作。超凈工作臺(tái)----內(nèi)都裝有一個(gè)小電動(dòng)機(jī),粗過濾器,細(xì)過濾器,空氣的速度大約是27±3m／min。植物組織無菌培養(yǎng)的一般步驟植物組織無菌培養(yǎng)的一般步驟置于一個(gè)有螺絲蓋的玻璃瓶中濃度適當(dāng)?shù)南疽簾o菌蒸餾水3～4次將材料取出，置于一個(gè)已經(jīng)滅過菌的培養(yǎng)皿中對所要使用的器械進(jìn)行消毒使用這些消過毒的器械外植體接種到培養(yǎng)基上瓶口置酒精燈火焰上烘烤數(shù)秒鐘，然后迅速用瓶蓋或瓶塞封嚴(yán)第三章培養(yǎng)基1培養(yǎng)基的種類及組成培養(yǎng)基：供植物離體培養(yǎng)用的基質(zhì)，相當(dāng)于人工配制的“土壤”。由無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、有機(jī)附加物、水和介質(zhì)等幾大類組成，為培養(yǎng)物提供營養(yǎng)、水分和固定場所。在植物生物技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程中，研究者們根據(jù)不同的研究目的和培養(yǎng)物對營養(yǎng)的需求，開發(fā)出數(shù)十種組份各異的培養(yǎng)基配方（見附錄I）。對于培養(yǎng)基的命名，一般采用“發(fā)明人＋發(fā)表年份”或“培養(yǎng)基代號＋發(fā)表年份”表示，例如Murashige和Skoog（1962）也可表示為MS（1962）。培養(yǎng)基的類別，依據(jù)形態(tài)不同可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，前者因加有固化劑如瓊脂或卡拉膠而呈固體狀態(tài)，后者不加固化劑，培養(yǎng)基為液體。兩類培養(yǎng)基的操作和使用目的差別較大依據(jù)培養(yǎng)基中是否加有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和附加物質(zhì)，則可將培養(yǎng)基分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基，前者只含有無機(jī)營養(yǎng)物（包括大量元素和微量元素）、維生素、氨基酸、碳水化合物和水。后者在前者，即基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)各種不同試驗(yàn)要求，附加一些物質(zhì)，如各種植物生長調(diào)節(jié)劑：BA、ZT、KT、2-iP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等，以及其他的復(fù)雜有機(jī)附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麥芽膏等。由于離體的培養(yǎng)材料不象完整植物體那樣具有自我平衡的能力，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)考慮離子平衡和物質(zhì)平衡問題，離子失衡或某種物質(zhì)過量都可能導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡。目前，無論液體培養(yǎng)還是固體培養(yǎng)，大多數(shù)植物離體培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基都是由無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等幾大類組成.1.1無機(jī)營養(yǎng)物（無機(jī)鹽類）無機(jī)營養(yǎng)物主要包括大量元素和微量元素，有時(shí)也包括少許有益元素。大量元素包括N、P、K、Ca、Mg、S，它們是植物細(xì)胞中構(gòu)成核酸、蛋白質(zhì)、酶系統(tǒng)、葉綠體以及生物膜所必不可少的元素。1.1無機(jī)營養(yǎng)物（無機(jī)鹽類）-NN通常為硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，在培養(yǎng)基中多以KNO3或NH4NO3的形式提供，或?qū)⑾鯌B(tài)氮與銨態(tài)氮配合使用，培養(yǎng)基中一定濃度的氮素不僅為培養(yǎng)物的生長提供營養(yǎng)，而且是胚胎發(fā)生的必需條件之一。一般而言，培養(yǎng)基中至少需要含有各為25mmol.L-1的硝酸鹽和鉀鹽。銨的含量超過8mmol.L-1時(shí)對培養(yǎng)物有毒害作用，但對常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來說，若硝態(tài)氮和銨態(tài)氮同時(shí)存在，則培養(yǎng)基中的總N量可提高到60mmol.L-1。1.1無機(jī)營養(yǎng)物（無機(jī)鹽類）-P.KP是植物的必需元素之一，參與生命活動(dòng)中核酸及蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用以及能量的貯存、轉(zhuǎn)化與釋放等重要的生理生化過程，在離體培養(yǎng)中需要大量的P；K是主要的陽離子，近年來在培養(yǎng)基中的用量呈逐漸提高的趨勢；Ca、Mg、S的用量相對少一些，濃度在1～3mmol.L-1范圍內(nèi)較適宜。1.1無機(jī)營養(yǎng)物（無機(jī)鹽類）微量元素是指Fe、Cu、Mn、B、Zn、Mo和Cl等，其需要量很少，一般用10-5～10-7mol.L-1,過多則產(chǎn)生毒害。另外，Cl在自然界廣泛存在，一般無須另行添加。有益元素是指非必需的、但對培養(yǎng)物的生長發(fā)育有益的一些元素，如硅（Si）、碘（I）、硒（Se）、鈷（Co）和鈉（Na）等，在某些植物如水稻、鹽生植物、C4植物和景天酸代謝植物的離體培養(yǎng)中常有使用，另外，幾乎所有的培養(yǎng)基配方中都含有碘元素。各種元素中，除Fe以螯合形式(如Fe-EDTA)供給、少部分的氮素由有機(jī)氮供給外，其它的元素一般以離子態(tài)提供。1.2碳源（carbonsources）和能源離體培養(yǎng)中的外植體材料，由于其光合作用能力較低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物作為生長發(fā)育的能源，這些碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類物質(zhì)最為重要。它們的作用除了提供培養(yǎng)物所需的碳骨架外，還提供能源，并可調(diào)節(jié)滲透壓一般地說，蔗糖是最好的糖源。它具有熱易變(heat-liable)的性質(zhì)，經(jīng)高壓消毒后，大部分分解為D-葡萄糖、D-果糖，有利于培養(yǎng)物吸收。其次，是葡萄糖和果糖。棉子糖在胡蘿卜離體培養(yǎng)中的作用，僅次于蔗糖和葡萄糖，但比果糖效果好。山梨糖（醇）則是薔薇科植物培養(yǎng)物的最好或較好的糖源，這可能與它在薔薇科植物活體中也是最占優(yōu)勢的糖類物質(zhì)有關(guān)。淀粉作為碳源對含糖量較高的植物組織來源，有較好的效果。大多數(shù)植物細(xì)胞對蔗糖的需求范圍是1～5%（可維持的滲透壓范圍在-152～-145kPa），過低的糖濃度不能滿足細(xì)胞營養(yǎng)、代謝和生長的需要，但過高的糖也是不利的，可能會(huì)干擾正常糖類物質(zhì)的代謝，或?qū)е屡囵B(yǎng)系統(tǒng)的滲透壓增加，從而阻礙了細(xì)胞對水分的吸收。在幼胚培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)，需要較高濃度的糖類物質(zhì)，一般為10%左右或更高。原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)，若糖類(以及醇類)的濃度不夠高，原生質(zhì)膜外的滲透壓比膜內(nèi)的低得多，原生質(zhì)體就會(huì)破裂除單糖外，其他糖一般須在細(xì)胞體外分解后而被吸收。植物細(xì)胞壁中存在著各種水解酶。胡蘿卜的轉(zhuǎn)化酶比較弱地結(jié)合在細(xì)胞壁中，若用酶法制取原生質(zhì)體，有50～60%的酶稀釋于培養(yǎng)基中。若以蔗糖為糖源對這種細(xì)胞進(jìn)行液體培養(yǎng)，則大約經(jīng)12小時(shí)后，絕大部分解為葡萄糖和果糖。維生素類維生素類的種類很多，與植物體內(nèi)各種酶的形成有關(guān)。由于離體培養(yǎng)中外植體合成維生素的能力較弱，需加部分的外源維生素才能利于發(fā)育。在離體培養(yǎng)中通常以B族維生素為主，使用濃度一般為0.1～10mg.L-1。其中，鹽酸硫胺素（VB1）是幾乎所有的培養(yǎng)物所必不可少的，而煙酸、鹽酸吡哆素(VB6)、生物素及維生素C和B12也比較常用。VB1用量在0.1～0.3mg.L-1之間，特別是在低水平細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，更是不可少肌醇（環(huán)己六醇）是一種特殊的物質(zhì)，其本身不促進(jìn)外植體的生長，但可能有助于化學(xué)物質(zhì)發(fā)揮作用，特別是能提高VB1的效果，從而促進(jìn)外植體生長、胚狀體發(fā)育和芽的分化，肌醇的用量為50～100mg.L-1。維生素類一般易溶于水，但耐熱性差，高溫下易降解。1.4氨基酸、酰胺類及有機(jī)附加物在一些培養(yǎng)基中加入一些氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，除提高營養(yǎng)外，可起到緩沖和調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的體內(nèi)營養(yǎng)平衡的作用，能夠促進(jìn)離體根的生長，促進(jìn)培養(yǎng)物的生長發(fā)育。例如絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥胚狀體和不定芽的分化，水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）含有多種氨基酸，對胚狀體或不定芽的分化也有良好的促進(jìn)作用氨基酸的通常用量為2～3mg.L-1，水解酪蛋白和水解乳蛋白的用量一般為0.05～0.1%。此外，有些情況下還可加入成份更復(fù)雜的天然復(fù)合物質(zhì)，包括天然營養(yǎng)物、中草藥甚至保健品等，常用的為椰乳、酵母提取液、番茄汁和香蕉泥等，使用濃度分別為10～20%、0.5%、5～10%和100～200g.L-1，這些物質(zhì)中含有天然激素等多種活性物質(zhì)，香蕉泥還具有較好的pH緩沖作用，在蘭花離體培養(yǎng)中應(yīng)用較多。椰乳（CM，CW）的活性成分是耐熱的，其制備方法為，將新鮮椰子汁煮沸后用數(shù)層紗布過濾，去除蛋白質(zhì)后冰凍保存?zhèn)溆谩?.5植物生長調(diào)節(jié)劑生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，其用量雖然極少，但對外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和分化起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用，其中最常用的是生長素類和細(xì)胞分裂素類。１）生長素類生長素類是一類刺激細(xì)胞伸長的化合物，能引起細(xì)胞性質(zhì)或次級代謝機(jī)能變化。生長素的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)受傷組織表面的一至數(shù)層細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，形成愈傷組織、促進(jìn)胚狀體的分化和試管苗的生根，另外，當(dāng)生長素與一定比例的細(xì)胞分裂素配合使用時(shí)，還能誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生。常用的生長素有2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）和IAA（吲哚乙酸）等，它們的活性強(qiáng)弱順序?yàn)?,4-D>NAA>IBA>IAA。IAA的使用濃度一般為10-5～10-10mol.L-1，常用1～10mg.L-1，2,4-D為10-5～10-7mol.L-1，NAA的濃度范圍則比前兩者都大IAA是生物合成的激素，見光或在酶促氧化作用下容易降解失活。另外，因培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)含有IAA氧化酶，會(huì)破壞外源IAA的活性，故IAA的使用濃度一般較高（1～30mg.L-1），NAA和2,4-D是人工合成的生長調(diào)節(jié)劑，性質(zhì)穩(wěn)定，不會(huì)被酶氧化和降解，使用濃度以一般以0.1～2mg.L-1為宜。２）細(xì)胞分裂素類現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)天然的細(xì)胞分裂素物質(zhì)約十多種，同時(shí)也有一些人工合成的物質(zhì)具有細(xì)胞分裂素活性，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為細(xì)胞分裂素。常用的細(xì)胞分裂素有激動(dòng)素（KT）、6-卞基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-異戊烯腺嘌呤（2-iP）、腺嘌呤（AD）、二苯脲、吡效?。?PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ，又名苯基噻二唑基脲）等.它們的主要作用是：①促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大；②誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)與生長；③增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成，抑制衰老；④能夠改變其它激素的作用。其活性的強(qiáng)弱順序?yàn)門DZ，4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT>AD。最常用的分裂素是性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格適中的6-BA和KT，使用濃度為10-6～10-7mol.L-1。３）赤霉素類赤霉素（GA），市售的GA是赤霉菌發(fā)酵液的粗提物，含有多至15種的赤霉素，離體培養(yǎng)中使用的赤霉素一般是赤霉酸（GA3），也是一種天然產(chǎn)物，溶于甲醇、乙醇或碳酸氫鈉溶液，在水中會(huì)迅速分解，故需用乙醇溶解并保存。赤霉素的主要作用是，誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對根的細(xì)胞則無效；對形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長素有協(xié)同作用，即IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部分化，比值低則利于韌皮部分化；可以代替低溫和長日照，使一些兩年生植物在當(dāng)年就開花，加快發(fā)育進(jìn)程，具有打破休眠、促進(jìn)休眠種子和器官萌發(fā)的作用；此外，赤霉素還對生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用。（４）脫落酸（ABA）除特殊的研究外，植物離體培養(yǎng)中一般不使用脫落酸，但了解脫落酸的知識(shí)是很有必要的，它可以幫助我們考慮和分析問題，如激素間的相互作用、采樣時(shí)期、環(huán)境條件、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的狀況對培養(yǎng)材料的影響等。一般地，脫落酸具有抑制蛋白質(zhì)合成、抵消或抑制生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素發(fā)揮作用的功效，并能夠誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落的發(fā)生。但是，也有報(bào)道認(rèn)為ABA對培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生有促進(jìn)作用，例如甘薯塊根和柳杉下胚軸切段培養(yǎng)物產(chǎn)生芽，荔枝幼胚培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體等。近期植物生理學(xué)的研究進(jìn)展表明，脫落酸是一類生理作用相當(dāng)復(fù)雜的激素，它在離體培養(yǎng)中的作用需要進(jìn)一步的研究。（５）乙烯及其它生長抑制劑幾乎所有的植物組織都能產(chǎn)生乙烯。乙烯的生理作用有，促進(jìn)果實(shí)成熟、促進(jìn)脫葉和衰老；促進(jìn)次生物質(zhì)的排泌；促進(jìn)菠蘿開花、增加黃瓜等的雌花數(shù)量等在離體培養(yǎng)中，生長素用量過高會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生乙烯；當(dāng)培養(yǎng)物生長得太密集擁擠、長期不予繼代轉(zhuǎn)接時(shí)，乙烯含量會(huì)增高，從而加速培養(yǎng)物衰老或脫葉，較高的乙烯還引起植物在形態(tài)上的一些改變，如使豌豆的上胚軸加粗、失去負(fù)向地性等。除此之外，離體培養(yǎng)中有時(shí)還會(huì)用到多效唑、烯效唑、三碘苯甲酸（TIBA）、矮壯素、比久（B9）、根皮苷、間苯三酚（根皮酚）等生長抑制劑，用以抑制徒長或細(xì)胞的旺盛分裂，提高試管苗的質(zhì)量。有研究證明根皮苷可提高蓮葉秋海棠、雪松、月季的芽苗分化，根皮苷分解后產(chǎn)生的根皮酚也有類似的效果，三碘苯甲酸則能夠促進(jìn)秋海棠的離體培養(yǎng)葉片形成芽。根皮苷的用量一般為1～7mg.L-1。1.6瓊脂或卡拉膠瓊脂是從紅藻等海藻中提取的一種高分子碳水化合物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，它不參與代謝、不提供營養(yǎng)（但不純的瓊脂中常會(huì)有一些微量元素），在植物離體培養(yǎng)中一直被作為首選的固化劑。瓊脂的用量一般在4～10g.L-1之間。近年來一些廠家生產(chǎn)的“卡拉膠”為粉狀的瓊脂，其用量應(yīng)小于條狀瓊脂如果是研究植物組織或細(xì)胞的營養(yǎng)問題，則應(yīng)避免使用瓊脂，因?yàn)槭惺鄣沫傊瑤缀醵己幸恍╇s質(zhì)，特別是鈣、鎂和一些微量元素。瓊脂純化：為了得到更純凈的瓊脂，可將干瓊脂450g放在8L大瓶中，加蒸餾水5L和吡啶0.5L，20小時(shí)后濾去液體，用蒸餾水沖洗3次，再用95％酒精浸泡12小時(shí)，取出并晾干。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家和加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌的溫度、時(shí)間、pH值等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過酸及高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，失去凝固能力。存放時(shí)間過久，也會(huì)逐漸失去凝固力，在使用中應(yīng)注意1.7活性炭活性炭的作用,利用其吸附能力降低分泌物的毒害作用;可使培養(yǎng)基變黑，有利于大多數(shù)植物的離體生根；對形態(tài)發(fā)生和器官形成有良好的效應(yīng).例如，活性炭可以促進(jìn)花藥培養(yǎng)時(shí)的雄核發(fā)育，有利于形成單倍體植株；懸浮培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞失去胚狀體發(fā)生能力后，通過添加1～4%的活性炭可恢復(fù)其胚胎發(fā)生能力。一般認(rèn)為，活性炭具有強(qiáng)大的吸附能力，能夠吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子，但其吸附的選擇性很差，既吸附有害物質(zhì)，也吸附有利物質(zhì)如激素和維生素類等，故使用的濃度不宜過高，一般在0.1～0.5%?；钚蕴康奈侥芰€與溫度有關(guān)，低溫下吸附能力強(qiáng)，高溫下吸附能力減弱，甚至解吸附。另外，大量的活性炭會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，此時(shí)需提高瓊脂的用量，很細(xì)的活性炭粉末容易沉淀，應(yīng)在培養(yǎng)基凝固之前搖晃混勻1.8硝酸銀AgNO3中的Ag+通過競爭性地結(jié)合于細(xì)胞膜上的乙烯受體蛋白，能起到抑制乙烯活性的作用。因此，在培養(yǎng)基中加入適量的AgNO3，有促進(jìn)愈傷組織分化器官或胚狀體的作用，能使某些原來再生困難的物種再生植株，并對克服試管苗玻璃化、早衰及落葉等有明顯效果。1.9染色劑的利用在進(jìn)行離體培養(yǎng)研究時(shí)通常需配制不同的培養(yǎng)基，或加入不同的植物激素，以觀察培養(yǎng)物的變化，確定最適宜的配方。除了用鉛筆或油筆標(biāo)記外，一個(gè)可行的辦法，是在培養(yǎng)基中滴加1～3滴1％的活體染色劑，如亞甲蘭、中性紅、甲基紫等，將培養(yǎng)基染成不同的淡顏色，由于染色劑用量極微，不會(huì)對培養(yǎng)物產(chǎn)生影響，利用此法能夠節(jié)約大量的時(shí)間。另外，甲基紫除供染色之外，還具有較強(qiáng)的殺菌作用，0.001％即可有效地抑制細(xì)菌和部分真菌的生長1.10抗生素的利用對于內(nèi)生菌的情況，可使用抗生素類物質(zhì)進(jìn)行抑菌，經(jīng)試驗(yàn)，甲基托布津、多菌靈、百菌清都有較好的效果，另據(jù)報(bào)道，鏈霉素、青霉素、地霉素、新霉素、夾竹桃霉素、抗菌肽等物質(zhì)都具有降低內(nèi)生菌污染的效果，可酌情試用。2幾類常用培養(yǎng)基的特性自1937年White建立第一個(gè)植物組織培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基以來，許多研究者報(bào)道了相當(dāng)多的培養(yǎng)基配方，這些配方因其成分（主要是無機(jī)鹽）水平的不同，可以大體劃分成幾類，并各具特點(diǎn)而適用于不同的培養(yǎng)目標(biāo)。根據(jù)無機(jī)鹽用量，培養(yǎng)基類型可以分為高鹽型培養(yǎng)基，高KNO3型培養(yǎng)基，中鹽型培養(yǎng)基，低鹽型培養(yǎng)基。2.1高鹽型培養(yǎng)基MS是使用最廣泛的培養(yǎng)基。其特點(diǎn)是無機(jī)鹽濃度高，養(yǎng)分齊全，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量高，比例也比較適合，不需要添加更多的有機(jī)附加物，離子平衡情況較好，使用的誤差較小。利于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，能滿足植物組織對礦質(zhì)營養(yǎng)的要求，適用于高需肥量植物種類或生長迅速的培養(yǎng)材料。MS基本培養(yǎng)基的全部組份見243頁附錄4。與MS培養(yǎng)基較為接近的配方，還有LS（1965）和RM（1964），它們的基本成分均同于MS，但前者去掉了甘氨酸、煙酸和鹽酸吡多醇，后者則把硝酸銨從1650mg.L-1升至4950mg.L-1，磷酸二氫鉀從170mg.L-1升至510mg.L-1，成為一個(gè)極高鹽的配方?？蓺w入此類的配方還有BL，BM，ER和MT等2.2高KNO3型培養(yǎng)基對于喜鉀、喜硝或忌銨的外植體材料而言，選用此類培養(yǎng)基是比較適宜的，此類配方有B5（1968）和N6（1974），前者的特點(diǎn)是銨鹽較低，鹽酸硫胺素較高，對枇杷胚狀體的誘導(dǎo)效果較佳。后者由我國的朱至清等發(fā)明，高硝酸銨，不含鉬，特別適用于禾谷類作物的花藥培養(yǎng)，曾獲國家發(fā)明二等獎(jiǎng)，在國內(nèi)外都有廣泛的使用。2.3中鹽型培養(yǎng)基中鹽型培養(yǎng)基包括H（1967），Nitsch（1969）和Miller（1963）等，在離體培養(yǎng)中也有廣泛的應(yīng)用。2.4低鹽型培養(yǎng)基低鹽型培養(yǎng)基的特點(diǎn)是無機(jī)鹽濃度低，適用于生根培養(yǎng)、成熟胚胎培養(yǎng)或種質(zhì)材料的保存，包括White（1943），改良White（1963），HB（1963），WS（1966）和Knop（1965）等，其中Knop（1965）僅包括4種成分，可用作水培的培養(yǎng)液，改良White（1963）則比較多用于木本植物。3培養(yǎng)基的配制用于配制培養(yǎng)基的水最好是蒸餾水或雙蒸水，所用的各種化學(xué)藥品應(yīng)盡可能采用分析純或化學(xué)純級別的試劑，以免雜質(zhì)對培養(yǎng)物造成不利影響。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確，不同的化學(xué)藥品需使用不同的藥匙，避免藥品的交叉污染與混雜。稱量時(shí)應(yīng)特別仔細(xì)，每稱取一種藥品都應(yīng)隨時(shí)記錄稱量情況(包括品名、重量等)，以免重復(fù)或弄錯(cuò)，又便于實(shí)驗(yàn)后分析。國內(nèi)化學(xué)試劑的分級與縮寫分級英文縮寫標(biāo)簽顏色優(yōu)級純試劑GuaranteedreagentGR綠分析純試劑AnalytialreagentAR紅化學(xué)純試劑ChemicalpureCP藍(lán)實(shí)驗(yàn)試劑LaboratoryreagentLR中黃3.1母液配制及保存培養(yǎng)基的配制應(yīng)遵循一定的方法程序。培養(yǎng)基母液：又叫貯備液，是在配制培養(yǎng)基時(shí)事先配好的濃縮液。培養(yǎng)基母液類型包括無機(jī)鹽、維生素以及在水溶液中穩(wěn)定的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等一個(gè)常規(guī)的方法是預(yù)先配制好不同組分的培養(yǎng)基母液，配成培養(yǎng)基配方使用濃度的10倍或100倍，甚至1000倍。平時(shí)貯存在2～4℃冰箱內(nèi)，待配制培養(yǎng)基時(shí)取出，按比例稀釋配用。這樣每種藥品稱量一次，可以使用多次，并可減少多次稱量所帶來的誤差。母液的配制有兩種方法：一種是配制成單一化合物母液，一種是配成幾種不同化合物的混合母液。前一種方法適合配制多種培養(yǎng)基都需要的同一種母液，后一種方法在大量配制同種培養(yǎng)基時(shí)省時(shí)省力。配好的母液應(yīng)保存在棕色瓶中貯存以MS為例介紹培養(yǎng)基的制作方法該配方中除蔗糖和瓊脂外，還包括有19種成分，1.核實(shí)試劑，計(jì)算。2.配制母液。為減少配制母液的工作量，可把幾種藥品（如培養(yǎng)基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但應(yīng)注意各種化合物的組合以及加入的先后順序，以免發(fā)生沉淀。通常把每種試劑單獨(dú)溶解后再與別的也已完全溶解的藥品混合，或者待前一種化合物完全溶解后再加入后一種化合物?；旌弦讶芙獾母鞣N無機(jī)鹽時(shí)還應(yīng)注意先后順序，必須把CaCl2與SO42-和PO43-錯(cuò)開，以免形成硫酸鈣或磷酸鈣的不溶物，另外，F(xiàn)e2+容易與某些陰離子如OH-結(jié)合形成沉淀而失效，故鐵元素需單獨(dú)配制成螯合鐵母液。對于植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，配制成母液時(shí)，一般宜配制成0.5或1.0mg.mL-1的母液，這樣的濃度既便于計(jì)算也可避免冷藏時(shí)形成結(jié)晶。由于多數(shù)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水，因此配法各不相同。大體上，酸類物質(zhì)（如生長素類和脫落酸）和苯基脲類物質(zhì)可用少量的1mol.L-1NaOH溶解，蒸餾水定容，堿類物質(zhì)（如腺嘌呤的衍生物）可用數(shù)滴1mol.L-1的HCl溶解，蒸餾水定容，GA3用95％酒精溶解及定容，玉米素可先溶于少量95％酒精中再加水定容。另外，IAA，IBA、NAA和2,4-D也可用95％酒精溶解，蒸餾水定容。所有的生長調(diào)節(jié)劑母液應(yīng)貯于試劑瓶中，存放在冰箱內(nèi)避光保存。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的表示有兩種單位：以前常用ppm(或每升毫克數(shù))，現(xiàn)狀更提倡用mol.L-1，它們之間的換算方法見有關(guān)資料。3.貼標(biāo)簽。配制好的各種母液應(yīng)分別貼上標(biāo)簽，寫明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配1L培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)吸取的量。母液最好在2～4℃3.2培養(yǎng)基的煮制配制培養(yǎng)基時(shí)先將貯存母液按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿、量筒、燒杯、移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置。稱量好所需的瓊脂、蔗糖、蒸餾水，配好所需用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，準(zhǔn)備好分裝容器。先在燒杯或鍋內(nèi)放一定量的蒸餾水，加入瓊脂和蔗糖并加熱溶解，然后按母液順序，根據(jù)不同母液的不同倍數(shù)吸取規(guī)定的量。加完所有的培養(yǎng)基組份（包括所需的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)）后，繼續(xù)加溫并不斷攪拌，待瓊脂完全溶化后定容3.3pH值的調(diào)整由于培養(yǎng)基的pH值直接影響到培養(yǎng)物對離子的吸收，因而過酸或過堿都對植物材料的生長有很大影響；另外，培養(yǎng)基的pH值還影響瓊脂的凝固。所以，當(dāng)培養(yǎng)基配制好后應(yīng)立即進(jìn)行pH值的調(diào)整。最好用酸度計(jì)測試，既快又準(zhǔn)，如無條件也可用精密pH試紙，但最好多用一兩種試紙同時(shí)測定，免得一種pH試紙偏差太大而明顯影響外植體的生長。培養(yǎng)基若偏酸時(shí)用lmol.L-1的NaOH來調(diào)節(jié)，偏堿則用1mol.L-1的HCl調(diào)節(jié)。一般將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到5.4～6.0。如果pH值高于6.0，培養(yǎng)基會(huì)變硬，pH值低于5.0，則不能很好地凝固。pH計(jì)/酸度計(jì)PH試紙3.4培養(yǎng)基的分裝與滅菌配制好的培養(yǎng)基要趁熱分裝。一般以占試管、三角瓶等培養(yǎng)容器的1/5～1/4為宜。太多會(huì)浪費(fèi)培養(yǎng)基，而且減少培養(yǎng)材料的生長空間；太少則會(huì)因營養(yǎng)不夠而限制生長。當(dāng)用試管制備瓊脂固化培養(yǎng)基時(shí)，若是用于初代培養(yǎng)，最好把試管斜置，將培養(yǎng)基制成斜面，為外植體的接種提供一個(gè)較大的面積，便于觀察生長效果。培養(yǎng)基分裝后應(yīng)立即進(jìn)行熱壓滅菌處理。若不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱或冰柜中，在24h內(nèi)完成滅菌工作高壓滅菌鍋的使用注意事項(xiàng)：1.消毒滅菌時(shí)，在壓力表讀數(shù)為1.1kg/cm-2或0.1Mpa，121℃2.在蒸汽滅菌鍋增壓前應(yīng)先將滅菌鍋內(nèi)的冷空氣放盡。排冷空氣可用下列辦法：事前打開滅菌鍋放氣閥，煮沸15min后再關(guān)閉或等大量熱蒸氣排出后再關(guān)閉；3.培養(yǎng)基消毒滅菌時(shí)間不宜過長，也不可超過滅菌鍋規(guī)定的壓力范圍，否則培養(yǎng)基中的蔗糖、有機(jī)物質(zhì)，特別是維生素類物質(zhì)就會(huì)分解，導(dǎo)致培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。4.當(dāng)滅菌完成后，應(yīng)切斷電源或熱源，待滅菌鍋內(nèi)氣壓接近“0”時(shí)，方可打開放氣閥，擰開滅菌鍋蓋取出培養(yǎng)基。對于吲哚乙酸、玉米素及某些維生素等遇熱不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)，不能進(jìn)行高壓蒸氣滅菌，應(yīng)改用過濾方法滅菌。通常采用減壓過濾裝置和過濾滅菌器，前者主要由過濾器和抽氣系統(tǒng)兩部分構(gòu)成。但所有器皿事先均應(yīng)高溫蒸氣滅菌3.5培養(yǎng)基的保存與使用培養(yǎng)基凝固后，將其放到培養(yǎng)室中2～3d，若沒有雜菌污染即可放心使用。暫時(shí)不用的培養(yǎng)基應(yīng)放置于10℃下保存，而含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基在4～5℃生長調(diào)節(jié)劑配制過程先用有機(jī)溶劑或堿溶解,溶解后將生長調(diào)節(jié)劑溶液倒入水中,則不是反過來。例子：高濃度的NAA配制時(shí)，如果是將水倒入已溶解的NAA溶液中，容易導(dǎo)致已溶解的NAA沉淀含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基滅菌方法通常加入到培養(yǎng)基中再高溫滅菌而活性不會(huì)明顯喪失的有:2,4-D,NAA通常加入到培養(yǎng)基中再滅菌,但活性會(huì)部分喪失的有:ABA,BA,GA3,IAA,IBA,KT,TDZ,ZT通常只采用過濾除菌的有:CPPU脲類細(xì)胞分裂素,GA4,GA7,JA茉莉酸甲酯培養(yǎng)基母液的配制大量元素10倍母液：含NH4NO3,KNO3,MgSO4,KH2PO4,宜4C冰箱內(nèi)貯藏，也可滅菌后室溫貯藏微量元素1000倍母液,含H3BO3,ZnSO4,MnSO4,Na2MoO4,CuSO4,CoCl2。后3者取用量很少,稱量困難,可以先配成10mg/ml的溶液,然后吸取所需量。該母液宜分裝成1ml每管,貯于-20C,每次取1管配成1L培養(yǎng)基抗生素的配制不同抗生素用不同溶劑溶解，如用水溶解的有：Amp，Carb，Kan，Cef；用甲醇或乙醇溶解的有：Cm，Rif，Tet?？股匾话闩渲瞥?000～10000倍母液，總濃度一般在100mg/ml以內(nèi)，頭孢霉素可達(dá)250mg/ml。抗生素用無菌水或有機(jī)溶劑配制后分裝冰凍保存，不用滅菌。液體和固體培養(yǎng)基的配制液體培養(yǎng)基：先取適量水,再加各種母液(抗生素和某些植物激素在滅菌冷卻后再加),每加一種后攪拌均勻,再稱取適量蔗糖和少數(shù)其它試劑,溶解后調(diào)節(jié)pH,定容。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值前加入瓊脂或瓊脂粉，加熱溶解后調(diào)節(jié)pH值和定容。第四章離體培養(yǎng)基本技術(shù)

----外植體第一節(jié)外植體的類型及其選擇與處理外植體是指用于接種培養(yǎng)的各種離體的植物材料，包括胚胎材料、各種器官、組織、細(xì)胞甚至原生質(zhì)體等。也就是說，外植體是從植物體上取下的用于離體培養(yǎng)的材料，而不管該材料是植物體的哪一部分（大可以是胚胎、器官，小可以是細(xì)胞、甚至原生質(zhì)體等）植物離體培養(yǎng)能否成功，既決定于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等外在因素，也決定于外植體這一重要的內(nèi)在因素。為了使外植體能在離體培養(yǎng)條件下存活與生長，必須對其進(jìn)行細(xì)致的選擇與處理，包括對供試植株的預(yù)處理、接種材料的制備和對材料的滅菌與切取等方面。同一植株的不同器官、組織或其它材料，以及植株的質(zhì)量、年齡、生理狀態(tài)、取材季節(jié)甚至天氣狀況等，都會(huì)直接或間接地影響離體操作和培養(yǎng)工作的成敗，因此，為了提高離體培養(yǎng)工作的成效，必須根據(jù)外植體的類型和試驗(yàn)的目的進(jìn)行必要的選擇1.1外植體的類型及其優(yōu)缺點(diǎn)—莖尖莖尖是園藝植物離體培養(yǎng)中應(yīng)用最多的一類外植體，這是由它的形態(tài)結(jié)構(gòu)特性決定的。莖尖在形態(tài)結(jié)構(gòu)上是植物地上部分的雛形，具有頂端分生組織、葉原基和腋芽原基，只需誘導(dǎo)生根即可成為完整植株（狹義莖尖培養(yǎng)）。莖尖作外植體的特點(diǎn)是：1.材料來源廣泛，操作簡單，成株容易，變異少。2.采用莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，不但生長速度快，繁殖率高，而且不容易產(chǎn)生遺傳變異，是最理想的起始材料之一。3.利用微莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，還是獲得無病毒植物的一個(gè)有效途徑，對園藝植物的科研與生產(chǎn)都具有十分重要的意義外植體的類型及其優(yōu)缺點(diǎn)—

莖段、花莖或花梗（帶節(jié)或不帶節(jié)的材料）莖尖是較好的培養(yǎng)材料，但取材可能有限，特別是對假軸分枝型植物來講，莖尖頂芽往往發(fā)育為花序，如月季、番茄、葡萄等植物，不注意觀察會(huì)把花蕾當(dāng)作莖尖取材，偏離研究的目標(biāo)。因此，對這一類植物可采用帶節(jié)的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，促使節(jié)位上的腋芽萌發(fā)，實(shí)現(xiàn)植株的再生。如果莖尖和帶節(jié)莖段的取材都不能滿足需要的話，也可采用不帶節(jié)的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，但這樣的莖段上不具有腋芽，須通過不定芽或胚狀體的誘導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)植株再生，多數(shù)情況下需經(jīng)過脫分化階段，其變異率會(huì)有所提高。莖段、花莖或花梗除此之外，在某些特殊的植物種類中，如果莖尖莖段都不能滿足取材需要的話，還可以采用花莖或花梗這樣的變態(tài)莖作為外植體，例如蝴蝶蘭屬于單莖性氣生蘭，植株上極少發(fā)育側(cè)枝，一般只有一個(gè)莖尖，如果直接從開花植株切取莖尖或莖段，就會(huì)犧牲植株，而以花梗側(cè)芽、花梗節(jié)間作為外植體，則能保住母株，而且成功率也比較高。1.1外植體的類型及其優(yōu)缺點(diǎn)—葉片葉的培養(yǎng)最早是作為葉片形態(tài)建成研究的手段，隨著離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，也作為一種比較常用的外植體材料。A.優(yōu)點(diǎn)：以葉片材料作為外植體，不但取材容易，操作方便，而且能夠大幅度擴(kuò)大外植體的來源，特別是對單子葉植物而言可以不損失親本植株，故在某些植物上應(yīng)用頗多。適于一些再生能力較強(qiáng)的植物種類。如番茄、芥藍(lán)、花椰菜、玫瑰、海棠、大巖桐、倒掛金鐘、矮牽牛、蘭花、豆瓣綠等植物，都可采用葉片為起始材料。B.缺點(diǎn)：由于葉片的分化程度較高，一般需要通過誘導(dǎo)愈傷組織并經(jīng)再分化才能產(chǎn)生植株，變異率較高。另外，對那些再分化能力弱的植物種類而言，葉片離體再生的難度相當(dāng)大。1.1外植體的類型及其優(yōu)缺點(diǎn)—花球、花蕾和花藥

A.花球和花蕾花球和花蕾中含有較多的分生細(xì)胞，具有較強(qiáng)的再生能力，也是較好的外植體材料。由于花球和花蕾屬于生殖器官，胚胎發(fā)生能力較強(qiáng)，一般可通過誘導(dǎo)胚狀體的途徑實(shí)現(xiàn)植株再生，但也有通過愈傷組織和不定芽成苗的報(bào)道，例如采用花椰菜的3mm直徑的花球組織、西瓜的2mm直徑的幼蕾作為外植體，都可經(jīng)過愈傷組織再分化綠苗。需要注意的是，以花球和花蕾為外植體時(shí)，因其中含有單倍體的細(xì)胞，所誘導(dǎo)的愈傷組織和再生植株中可能有單倍體類型。B.花藥用于單倍體植株的誘導(dǎo)。C花瓣幼胚、成熟胚、種子1）胚胎和種子本身就是一個(gè)結(jié)構(gòu)完整的微小生命體，是完整植株的雛形，只要提供適宜的培養(yǎng)條件，一般能夠直接生長發(fā)育成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的個(gè)體植株，其間不需要脫分化和再分化的過程。2）胚胎材料的另一特點(diǎn)，是具有較強(qiáng)的胚胎發(fā)生能力，特別是幼胚材料，由于胚性相當(dāng)強(qiáng)，研究中通常用于胚狀體的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于其它種類的外植體。子葉、下胚軸子葉和下胚軸作為胚的一部分，基本上也具有胚胎材料的特點(diǎn)，其再生能力和胚胎發(fā)生能力較強(qiáng)，多數(shù)情況下能夠直接誘導(dǎo)不定芽，其間不需要脫分化形成愈傷組織的過程，而且誘導(dǎo)率較高，遺傳較穩(wěn)定，因而被廣泛應(yīng)用于離體培養(yǎng)。外植體的選擇依據(jù)—外植體的生理狀態(tài)取材植株的生理狀態(tài)對離體培養(yǎng)的影響極為重要。幼嫩、生理狀態(tài)活躍的材料比較容易培養(yǎng)，而成熟衰老、生理活性衰弱、或者是處于休眠狀態(tài)的材料則難以培養(yǎng)。一般而言，春天植物開始生長，芽膨大而鱗片未開裂時(shí)取材最為合適，南方的植物則以春季剛萌動(dòng)的嫩芽或嫩梢為佳。一般情況下不提倡采用處于休眠狀態(tài)的外植體材料（如休眠的枝條或種子），發(fā)育年齡對培養(yǎng)材料的形態(tài)發(fā)生能力有較大的影響。。一般地，下部的芽及其長成的枝條的再生能力較強(qiáng)，越往上越接近成年態(tài)甚至老年態(tài)，再生能力呈遞減的趨勢。因此，對于木本植物而言，隨著年齡的增加，除莖尖以外，其它的所有芽的成年態(tài)性一般是越來越強(qiáng)，離體培養(yǎng)也越加困難，對于這樣的情況，需要改用幼年態(tài)材料或是對成年態(tài)材料進(jìn)行返幼處理，使其恢復(fù)幼態(tài)性后再行培養(yǎng)，才能提高成功的可能性。返幼處理的方式多種多樣，包括選用根蘗苗材料，將成年態(tài)枝條嫁接于幼年實(shí)生苗上，將成年樹從基部重截，促其萌發(fā)樁苗、低位苗或徒長枝后取材，或?qū)Τ赡陸B(tài)材料進(jìn)行生長激素（多用赤霉素或細(xì)胞分裂素類）處理等。通過返幼或部分返幼處理后，材料的培養(yǎng)相對容易成功，但隨之可能出現(xiàn)的一個(gè)后果，是再生植株的幼年期（包括營養(yǎng)期）也會(huì)延長，導(dǎo)致開花結(jié)果的時(shí)期延遲，這對于以收獲果實(shí)和以觀賞花器為目的的木本果樹和木本花卉而言，是一個(gè)不利的方面，需要妥善處理。1.2外植體的選擇依據(jù)—取材的季節(jié)取材季節(jié)的影響來自三個(gè)方面，一是不同的季節(jié)所提供的材料可能有所不同，如生殖器官材料只能在生殖生長階段取材；二是不同季節(jié)中的天氣情況可能影響外植體滅菌的效果，如在雨季取材往往導(dǎo)致較高的污染率；三是不同季節(jié)中材料的代謝情況有差異一個(gè)較好的方法，是將植株種植于在溫室內(nèi)，從溫室植株上取材，能夠最大限度地克服季節(jié)與氣候的干擾。1.2外植體的選擇依據(jù)—外植體的大小外植體大小也會(huì)影響材料的成活與生長情況。一般而言，外植體越小，接種的成活率就越低，較大的外植體有利于成活，但過大的外植體，又可能因難以徹底滅菌而增加污染。另一方面，在進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時(shí)，又要求外植體盡量的小，以提高脫毒的效率。因此，建立無菌材料時(shí)，采用的外植體大小，還應(yīng)根據(jù)不同植物材料和培養(yǎng)目的而異，一般選取0.5～1.0cm的外植體為宜，但如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的外植體，則可小至0.5cm以下，最小至0.1mm。除上述因素外，取材時(shí)還應(yīng)選擇優(yōu)良的基因型，并從健壯無病的植株上取材，2.1減少帶菌的處理減少材料的初始帶菌量是降低污染率的最有效的措施。最好是在長期晴朗的天氣條件下取樣、選擇新萌發(fā)的幼芽或嫩梢、選擇表面比較光滑的材料、對母株定期噴灑殺菌藥劑、用紙袋或薄膜袋將枝條封套保護(hù)待其萌發(fā)新芽后取樣、在室內(nèi)采用水插促芽后采樣，或是在溫室植株上采樣等，都可以大大減少初始帶菌量。2.2消毒劑的殺傷力和材料對消毒劑的耐受力不同的消毒劑種類，因其滲透力和化學(xué)性質(zhì)不同，對材料的殺傷力也不大相同。不同的外植體材料，因其大小、結(jié)構(gòu)、幼嫩程度的不同，對同一種消毒劑的耐受力也不相同。在選擇外植體材料時(shí)，則應(yīng)優(yōu)先考慮體積較大、帶菌量較少、耐受力較強(qiáng)的類型。對于堅(jiān)硬致密的外植體材料（如成熟種子），可采用滲透力強(qiáng)的消毒劑（如75％酒精）進(jìn)行表面滅菌，然后用0.1％升汞處理數(shù)十分鐘。外植體經(jīng)消毒劑處理后，必須用無菌水洗去殘存的消毒劑，否則其會(huì)對外植體造成長期的傷害，尤其是那些附著力強(qiáng)、難以洗去的消毒劑如升汞等，一定要清洗多次。某些植物（如蘭花）的外植體除表面帶菌外，由于組織結(jié)構(gòu)的特殊性，其內(nèi)部或淺表的組織也會(huì)帶菌，稱為“內(nèi)生菌”，對于這一情況，可在培養(yǎng)基中添加一定濃度的廣譜抗生素，抑制內(nèi)生菌的繁殖，并通過多次繼代培養(yǎng)逐漸消除。2.5切割與接種的技巧外植體的大小會(huì)影響成活率，故應(yīng)將材料切分成適宜的大小后接種。如果用于消毒的外植體比較大，則應(yīng)盡量切取其內(nèi)部的組織進(jìn)行接種，因?yàn)閮?nèi)部的組織一般是不帶菌的。接種的方向也比較重要，莖尖、莖段應(yīng)保持直立、先端向上接種，葉片材料可用插接，也可以平放于培養(yǎng)基表面，但平放時(shí)一般將葉背朝下，以利于對培養(yǎng)基的吸收。3褐變的防止褐變是植物離體培養(yǎng)中一個(gè)比較普遍發(fā)生的問題，外植體接種后，于傷口處發(fā)生褐化，產(chǎn)生褐色物質(zhì)，不僅使培養(yǎng)基變褐，而且可能造成培養(yǎng)物死亡，或嚴(yán)重抑制外植體的脫分化和器官分化。因此，褐變問題已成為離體培養(yǎng)的三大難題之一（另兩個(gè)問題是污染和玻璃化）。很多植物尤其是木本植物體內(nèi)含有較多的酚類化合物。當(dāng)外植體被切割后，切口附近細(xì)胞中酶與底物的分隔被破壞，在有氧氣存在的情況下，多酚氧化酶催化酚類物質(zhì)氧化成褐色的醌類，醌類物質(zhì)在酪氨酸酶的作用下，使外植體細(xì)胞中的蛋白質(zhì)聚合，生長停頓，最終導(dǎo)致死亡。3.2影響褐變的因素—基因型不同植物種類的褐變情況有很大差別。木本植物一般比草本植物容易發(fā)生褐變，這是因?yàn)槟颈局参镏写嬖谳^多的酚類物質(zhì)，而酚類的糖苷化合物，正是合成木質(zhì)素、單寧和色素的前體物質(zhì)。另一方面，即使是同種植物的不同類型或基因型，也因酚類物質(zhì)含量和酚氧化酶活性上的差異，發(fā)生褐變的程度也有不同。例如，蕉類種質(zhì)資源中，B組染色體組越多，莖尖褐變就越嚴(yán)重，繁殖成功率就越低；荔枝品種中，綠沙幼胚培養(yǎng)褐變嚴(yán)重，東劉1號則較輕。3.2影響褐變的因素—外植體的生理狀態(tài)及發(fā)育年齡一般說來，隨著年齡和組織木質(zhì)化程度的增加，褐變會(huì)有所加強(qiáng)。例如，荔枝（懷枝）的實(shí)生幼苗基本上不會(huì)褐變，而成年結(jié)果樹枝條的褐變則相當(dāng)嚴(yán)重；另外，分化程度高的材料（如葉片）比分化程度低的材料（如莖尖）容易褐變；成熟度高的材料比幼嫩材料容易褐變。切割外植體時(shí)，傷口創(chuàng)面大、外植體體積小的材料較易褐變，在取材和切割時(shí)應(yīng)注意。3.2影響褐變的因素—培養(yǎng)基組份的影響許多試驗(yàn)證明，液體培養(yǎng)基能有效地克服外植體的褐變，在液體培養(yǎng)基中加上濾紙橋，效果就更好。這是因?yàn)橥庵搀w溢出的有毒物質(zhì)可以很快擴(kuò)散到液體培養(yǎng)基中，從而減輕了對外植體的危害。培養(yǎng)基成分對褐變也有一定的影響，初代培養(yǎng)時(shí)，無機(jī)鹽濃度過高，會(huì)引起酚類物質(zhì)大量產(chǎn)生，加劇褐變，因此，適當(dāng)降低無機(jī)鹽濃度有利于減輕褐變。3.2影響褐變的因素—培養(yǎng)條件從田間自然光照下的植株上取材，接種后容易褐變，如果事先對母株或枝條遮光處理后再取材接種，則褐變可以減輕，這是因?yàn)樵诜宇惢衔锖铣珊脱趸^程中，有一部分酶