血球計數(shù)板的使用

顯微鏡直接(zhíjiē)計數(shù)法

江蘇省丹陽(dānyánɡ)高級中學(xué)高三備課組第一頁，共十五頁。一、實驗(shíyàn)目的1、明確顯微鏡計數(shù)的原理。2．學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。二、實驗材料

酵母菌懸液，血球計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細管、吸水紙等。第二頁，共十五頁。三、實驗原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點是直觀、快速。將經(jīng)過適當稀釋的菌懸液〔或孢子懸液〕放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的〔0.1㎜3〕，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目(shùmù)來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目(shùmù)。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。第三頁，共十五頁。血球計數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺。中間(zhōngjiān)的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九個大方格，中間(zhōngjiān)的大方格即為計數(shù)室，微生物的計數(shù)就在計數(shù)室中進行。第四頁，共十五頁。第五頁，共十五頁。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，共400小格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格，總共也是400小格。所以無論是哪種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的。每一個大方格邊長為1㎜，那么每一大方格的面積為1㎜2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度(gāodù)為0.1㎜，所以計數(shù)室的容積為0.1㎜3。第六頁，共十五頁。其計算方法如下：1．25×16的計數(shù)板計算公式細胞數(shù)/ml=(80小格內(nèi)的細胞數(shù)/80)×400×10000×稀釋(xīshì)倍數(shù)=A/5×25×104×B2．16×25的計數(shù)板計算公式細胞數(shù)/ml=(100小格內(nèi)的細胞數(shù)/100)×400×10000×稀釋倍數(shù)

=A/4×16×104×B第七頁，共十五頁。四、操作過程1．稀釋將酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2．鏡檢計數(shù)(jìshù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。假設(shè)有污物，那么需清洗后才能進行計數(shù)。第八頁，共十五頁。3．加樣品將清潔枯燥的血球(xuèqiú)計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴〔不宜過多〕，使菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。靜置5—10分鐘即可計數(shù)。第九頁，共十五頁。4．顯微鏡計數(shù)將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前假設(shè)發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個菌體為宜。假設(shè)選用(xuǎnyòng)25×16規(guī)格的計數(shù)板那么每個計數(shù)室選5個中方格，可選4個角和中央的中格〔即80個小格〕，假設(shè)選用(xuǎnyòng)16×25規(guī)格的計數(shù)板，那么數(shù)四個角：左上、右上、左下、右下的四個中方格，〔即100小格〕中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小到達母細胞的一半時，即作兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。第十頁，共十五頁。第十一頁，共十五頁。5.對每個樣品(yàngpǐn)計數(shù)三次，取其平均值，計算每1ml菌液中所含的酵母菌個數(shù)。

各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室

第二室

A-五個中方格(fānɡɡé)的總菌數(shù)B-稀釋倍數(shù)第十二頁，共十五頁。6．清洗血球計數(shù)板血球汁數(shù)板使用(shǐyòng)后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，或用95％的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機溶劑脫水使其枯燥。通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。假設(shè)不干凈，那么必須重復(fù)清洗直到干凈為止。第十三頁，共十五頁。7.本卷須知〔1〕實驗過程中發(fā)現(xiàn)，如何稀釋？如果發(fā)現(xiàn)每小格中酵母菌的個數(shù)多于10個，可按以下處理：取1ml酵母菌培養(yǎng)液參加到盛有9ml蒸餾水的試管中，搖勻，再計數(shù)；如發(fā)現(xiàn)酵母菌的個數(shù)仍然過大，那么同樣(tóngyàng)再稀釋一次，直至每小格中酵母菌的個數(shù)介于5-10，并作記錄?！?〕調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要(bùyào)偏向一邊，否那么視野中不易看清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線?！?〕因菌液在血球計數(shù)板處于(chǔyú)不同空間，要在不同焦距下才能看全，所以，觀察時必須不斷調(diào)細螺旋〔調(diào)焦距長短〕，方可找全。

〔4〕每個樣品重復(fù)2—3次，假設(shè)兩次差異太大應(yīng)重測。第十四頁，共十五頁。內(nèi)容(nèiróng)總結(jié)顯微鏡直接計數(shù)法。2．學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。在計數(shù)前假設(shè)發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新