第八組-項(xiàng)目二-鏈霉素的生產(chǎn)課件

鏈霉素的生產(chǎn)方案的制備制作小組：第八組一、概述 鏈霉素（streptomycin）是一種氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。1943年美國(guó)S.A.瓦克斯曼從鏈霉菌中分離得到，是繼青霉素后第二個(gè)生產(chǎn)并用于臨床的抗生素。它的抗結(jié)核桿菌的特效作用，開創(chuàng)了結(jié)核病治療的新紀(jì)元。從此，結(jié)核桿菌肆虐人類生命幾千年的歷史得以有了遏制的希望。（一）鏈霉素及其理化性質(zhì)

鏈霉素是氨基糖苷類抗生素。鏈霉素分子由鏈霉胍、鏈霉糖和N-甲基-L葡萄糖胺組成的三糖苷，在1，3-位置上帶有2個(gè)胍基的l，3-去氧青蟹肌醇，去掉2個(gè)脒基后稱為鏈霉胺。鏈霉糖是帶有支鏈的5’-脫氧五碳糖，在第3碳上有一個(gè)醛基。N-甲基-L-葡萄糖胺是在第2碳上的-NH2被甲基化(-CH3NH)的L-葡萄糖胺。這三糖連接的糖苷鍵都是α型的糖苷鍵。結(jié)構(gòu)式ieg實(shí)驗(yàn)儀器與材料培養(yǎng)基1.斜面高氏一號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉2%氯化鈉0.05%硝酸鉀0.1%三水磷酸氫二鉀0.05%七水硫酸鎂0.05%七水硫酸亞鐵0.001%瓊脂1.5%-2.0%pH：7.4-7.62.種子培養(yǎng)基可溶性淀粉3%玉米蛋白粉0.5%碳酸鈣2.0%玉米漿3.5%pH:7.0-7.53.發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖4.0%玉米淀粉3.5%玉米漿2.0%玉米蛋白粉3.0%NH4Cl0.5%NaCl1.5%CaCO31.5%泡敵0.05%pH7.0-7.2（二）實(shí)驗(yàn)菌種：灰色鏈霉菌，微生物實(shí)驗(yàn)室保藏（三）儀器：玻璃試管、試管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、洗耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250ml,500ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫箱、臺(tái)秤等液氮保藏(-196℃)沙土管保藏(2-4℃)原斜面孢子中罐種子小罐種子搖瓶種子斜面孢子(代1)大罐發(fā)酵液提煉車間斜面培養(yǎng)恒溫恒濕35-36℃，7天斜面培養(yǎng)恒溫恒濕34-35℃，6天搖瓶培養(yǎng)33-34℃，39.5hr轉(zhuǎn)速250rpm裝量80ml/750ml接種量一塊斜面/瓶50-64hr小罐種子培養(yǎng)36±0.5℃24-30h轉(zhuǎn)速60-300rpm，攪拌功率5.5kw通氣量2m3/min,罐壓0.03Mpa中罐種子培養(yǎng)36±0.5℃，25hr轉(zhuǎn)速60-240rpm接種量15%通氣量1.5VVM罐壓0.03Mpa攪拌功率22kw大罐發(fā)酵36±0.5℃，136hr轉(zhuǎn)速60-130rpm接種量15%通氣量0.75VVM罐壓0.04Mpa攪拌功率115kw

工藝流程或一、生產(chǎn)菌種早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)鏈霉素的生產(chǎn)菌種是灰色鏈霉菌。后來(lái)又找到了產(chǎn)鏈霉素的其他類型鏈霉素族抗生素(如羥基鏈霉素或雙氫鏈霉素)的菌種。如比基尼鏈霉菌、灰肉鏈霉菌等

。灰色鏈霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。孢子量很多，呈橢圓球形。氣生菌絲和孢子都呈白色。單菌落生長(zhǎng)豐滿，呈梅花形或饅頭形，直徑約為3～4mm?；鶅?nèi)菌絲透明，在斜面背后產(chǎn)生淡棕色色素。鏈霉素產(chǎn)生菌誘變育種常用的誘變劑有：紫外線、7射線、氮芥、乙烯亞胺、亞硝酸和硫酸二乙酯等。一些化學(xué)誘變劑又經(jīng)常和紫外線等進(jìn)行復(fù)合處理。近年來(lái)采用亞硝基胍、快中子和激光等，誘變選育出營(yíng)養(yǎng)缺陷型或再回復(fù)突變型高產(chǎn)菌株。雜交育種與誘變育種相結(jié)合的方法，對(duì)提高菌種的生產(chǎn)能力，收到了較好的效果。

(二)搖瓶種子培養(yǎng) 生產(chǎn)斜面的菌落接種到搖瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)即得搖瓶種子。鏈霉素發(fā)酵經(jīng)常使用：瓶種子來(lái)接種種子罐。種子質(zhì)量以菌絲階段、發(fā)酵單位、菌絲黏度或濃度、糖氮代謝、種子液色澤和無(wú)雜菌檢查為指標(biāo)。搖瓶種子(母瓶)可以直接接種子罐，也可以再擴(kuò)大培養(yǎng)，用培養(yǎng)所得的子瓶接種。搖瓶種子檢查合格后，貯存于冷藏庫(kù)內(nèi)備用，冷藏時(shí)間最多不超過7天。搖瓶培養(yǎng)基的成分為黃豆餅粉、葡萄糖、硫酸銨、碳酸鈣等，其中黃豆餅粉的質(zhì)量和葡萄糖的用量對(duì)種子質(zhì)量都有影響。葡萄糖用量多少對(duì)菌種的氨氮代謝和菌絲黏度有影響。在配制搖瓶培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)凋整好配比。(四)發(fā)酵培養(yǎng)（1）發(fā)酵培養(yǎng)基的配置

以發(fā)酵培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，按設(shè)定體積配置發(fā)酵培養(yǎng)基（先定容至15L），將除CaCO3和泡敵之外的物料加入罐中，加熱至80-90糊化25min，降溫至28用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2。在121滅菌，冷卻后補(bǔ)入無(wú)菌水至20L左右。

(2)火焰保護(hù)接種在發(fā)酵罐接種口，將培養(yǎng)28小時(shí)-30小時(shí)的搖瓶種子一10%接種于發(fā)酵罐中。(3)培養(yǎng)將接種后的發(fā)酵罐于33恒溫培養(yǎng)10天，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。(4)發(fā)酵樣的測(cè)定全程需補(bǔ)入滅過菌的水來(lái)控體積。每天需取樣測(cè)定pH、總糖、菌濃（濕重和干重）等指標(biāo)，鏈霉素的分離提純常用的提取方法活性炭吸附法溶劑溶媒萃取法復(fù)鹽沉淀法離子樹脂交換法鏈霉素的提取和精制發(fā)酵液粉針劑飽和樹脂原液水針劑成品濃縮液精制液洗脫液過濾洗脫吸附脫色中和精制脫色濃縮無(wú)菌過濾無(wú)菌過濾干燥1．發(fā)酵液的過濾及預(yù)處理發(fā)酵終了時(shí)，所產(chǎn)生的鏈霉素，有一部分是與菌絲體相結(jié)合的。用酸、堿或鹽作短時(shí)間處理以后，與菌絲體相結(jié)合的大部分鏈霉素就能釋放出來(lái)。工業(yè)上，常采用草酸或磷酸等酸化劑處理，以草酸效果較好，可用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝3左右，直接蒸汽加熱(70－75℃)，維持2min(這樣能使蛋白質(zhì)凝固，提高過濾速度)，迅速冷卻、過濾或離心分離。過濾后，所得酸性濾液也可進(jìn)行堿性處理，進(jìn)一步除去蛋白質(zhì)，或者直接用NaOH凋pH值至6.7—7.2。原濾液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般是：①外觀澄明；②pH＝6.7—7.2；③溫度在10℃以下；④高價(jià)離子含量很少；⑤鏈霉素濃度為5000U／ml左右。根據(jù)鏈霉素的穩(wěn)定性、解離度和樹脂的離解度，選擇原濾液pH值為中性附近，即pH＝7左右，既可保證鏈霉素不受破壞，又能使鏈霉素和鈉型羧基樹脂全部解離，有利于離子交換。為防止鏈霉素破壞，溫度應(yīng)適當(dāng)降低，維持在10℃左右 原液中高價(jià)離子(Ca2+，Mg2+)對(duì)離子交換吸附影響很大，因此必須在發(fā)酵液預(yù)處理時(shí)將這些離子除掉。草酸能將Ca2+去除掉。一些配合劑如三聚磷酸鈉(Na5P3O10)，能和Mg2+形成絡(luò)合物，減少樹脂對(duì)Mg2+的吸附。三、精制(1)高交聯(lián)度樹脂精制高交聯(lián)度的氫型磺酸樹脂的結(jié)構(gòu)緊密，金屬小離子可以自由地?cái)U(kuò)散到孔隙度很小的樹脂內(nèi)部與陽(yáng)離子交換，而有機(jī)大離子就難于擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部進(jìn)行交換。

經(jīng)過高交鏈度樹脂交換后，交換液變酸，需經(jīng)弱堿羥型樹脂中和，就得精制液。其反應(yīng)方程式如下。濃縮和活性炭脫色精制為了適應(yīng)干燥的濃度要求，精制液尚需蒸發(fā)濃縮。在濃縮之前還要用活性炭處理，即將所得的精制液用硫酸或氫氧化鋇調(diào)pH至4.3—5.0，并按精制液透光度的不同加人不同量的活性炭，進(jìn)行常溫脫色，得透光度在95％以上的濾液。由于鏈霉素是熱敏感物質(zhì)，受熱易破壞，故宜于低溫快速濃縮?？刂圃阪溍顾刈罘€(wěn)定的pH4.0—4.5，進(jìn)行真空薄膜蒸發(fā)濃縮，溫度控制在35℃以下，濃縮液應(yīng)達(dá)到350mg/mol左右。鏈霉素效價(jià)的測(cè)定效價(jià)測(cè)定的方法：（1）樣品處理A．發(fā)酵液浸提處理：稱取2g均勻后發(fā)酵液加丙酮浸提液9ml，超聲40min，8000r/min離心5min，取上清備用。若效價(jià)較高，可用0.1mol/L，pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩