張正昊答辯幻燈-PPT幻燈片

資料與方法3討論5小結(jié)

6前言

12結(jié)果4研究目的

前言隨著基因靶向藥物、造血干細(xì)胞移植等治療方法的廣泛開(kāi)展，白血病患者的長(zhǎng)期生存率大幅提高，但是仍然有相當(dāng)大的一部分患者面臨著復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。

微小殘留?。∕RD）是指白血病患者在治療達(dá)到完全緩解后，患者血液細(xì)胞計(jì)數(shù)正常，用形態(tài)學(xué)方法在骨髓和血液中都不能檢測(cè)出白血病細(xì)胞，但是用更敏感方法能檢測(cè)出的白血病細(xì)胞。

MRD緩解后患者復(fù)發(fā)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)雖然也能檢測(cè)出染色體的異常結(jié)構(gòu)，但檢測(cè)速度慢檢測(cè)靈敏性低對(duì)于復(fù)雜核型分析效果差熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)?；驹響?yīng)用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記克隆化的基因或DNA片段后，與染色體DNA進(jìn)行雜交，直接從染色體上檢查形成雜交部位的熒光信號(hào)。

經(jīng)典t(9;22)細(xì)胞信號(hào)(DF)能發(fā)現(xiàn)常規(guī)細(xì)胞遺傳方法無(wú)法檢測(cè)的基因或染色體重排

速度快、敏感性高，更適合臨床使用

12能檢測(cè)到間期細(xì)胞核的染色體異常

3可同時(shí)觀察數(shù)百個(gè)細(xì)胞，充分了解患者染色體信息4優(yōu)點(diǎn)研究目的探討：FISH敏感性是否優(yōu)于常規(guī)染色體核型分析FISH動(dòng)態(tài)隨訪微小殘留?。∕RD）的臨床意義FISH是否能反映白血病治療效果FISH是否能預(yù)測(cè)移植物抗宿主?。℅VHD）發(fā)生

資料與方法一般資料新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科2009.10-2010.10收治的白血病患者44例，收集骨髓標(biāo)本85份，男性27例，女性17例，中位年齡38（14～68）歲。其中漢族35例，維吾爾族4例，回族2例，錫箔族2例，哈薩克族1例。依據(jù)骨髓形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)確診CML25例M212例M33例B-ALL2例M01例M4b1例技術(shù)路線骨髓標(biāo)本

治療前組

陽(yáng)性患者給予干預(yù)性治療

造血干細(xì)胞移植組

藥物治療組

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,得出結(jié)論

檢測(cè)方法1.預(yù)處理：接種培養(yǎng)低滲固定2.老化：2×SSC液30分鐘，梯度脫水3.雜交：變性后，37℃溫箱16小時(shí)以上4.洗滌：0.4×SSC液；2×SSC/吐溫5.復(fù)染：DAPI復(fù)染6.鏡檢：觀察200個(gè)分裂間期細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)1.AML1/ETO雙色雙融合探針盒2.PML/RARA雙色雙融合探針盒3.BCR/ABL雙色雙融合探針4.X/Y紅綠雙色探針均購(gòu)于英國(guó)Cytocell公司。檢測(cè)指標(biāo)：白血病陽(yáng)性細(xì)胞率，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。表1FISH與常規(guī)染色體核型分析樣本陽(yáng)性率及對(duì)比分析注：P>0.05一致性檢驗(yàn)Kappa=0.819

1.FISH與常規(guī)染色體核型對(duì)比分析：結(jié)果

FISH檢測(cè)顯示15份(17.6%)樣本為陽(yáng)性，染色體核型分析11例(12.9%)為陽(yáng)性，有4例FISH顯示陽(yáng)性結(jié)果的樣本，染色體核型分析其中3例結(jié)果陰性，1例因中期分裂象極低，而無(wú)法分析。2.治療后患者的動(dòng)態(tài)隨訪造血干細(xì)胞移植后：在移植后1月，2例陽(yáng)性，給予免疫抑制劑減量等相關(guān)治療后轉(zhuǎn)陰。甲磺酸伊馬替尼：治療后3月內(nèi)1例陽(yáng)性，考慮藥物起效時(shí)間，囑繼續(xù)服藥，3月后復(fù)查轉(zhuǎn)陰。全反式維甲酸：所有檢測(cè)結(jié)果均為陰性。表2造血干細(xì)胞移植后各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)之間FISH結(jié)果比較

NMRD均值(%)標(biāo)準(zhǔn)差(%)1個(gè)月1-6個(gè)月6月以上162173.7192.4762.074.69391.55301.336注：組間比較P>0.053.FISH是否能反映白血病治療效果表3經(jīng)典方法治療前后患者FISH均值比較NMRD均值(%)標(biāo)準(zhǔn)差(%)移植后組藥物治療后組治療前組4612112.8374.95874.2273.03145.083218.7928總數(shù)6914.58727.3376注：兩治療組與治療前組比較P<0.01，兩治療組間P>0.054.MRD與GVHD是否有相關(guān)性表4GVHD發(fā)生組與未發(fā)生組FISH結(jié)果比較NMRD均值(%)標(biāo)準(zhǔn)差(%)未發(fā)生GVHD組發(fā)生GVHD組1264.2081.7505.20692.1852注：組間比較P>0.05

討論1.FISH具有方法學(xué)優(yōu)勢(shì)國(guó)內(nèi)外很多研究都對(duì)兩種檢測(cè)方法做了比較：如Brown等對(duì)69例G顯帶顯示陰性的患者進(jìn)行FISH檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中3例患者表現(xiàn)出染色體異常。本研究同樣在所有G顯帶陰性的患者中監(jiān)測(cè)出3例染色體異常。

在檢測(cè)敏感性方面，多數(shù)研究表明，F(xiàn)ISH的敏感性可以達(dá)到10-2-10-3

，本研究應(yīng)用FISH技術(shù)觀察200個(gè)細(xì)胞，敏感性達(dá)到0.005，比起常規(guī)染色體分析僅僅觀察20個(gè)細(xì)胞，敏感性提高了10倍以上。實(shí)驗(yàn)證實(shí)FISH技術(shù)速度快，靈敏性高，能夠檢測(cè)出常規(guī)染色體方法檢測(cè)不出或無(wú)法檢測(cè)的MRD。

然而，本實(shí)驗(yàn)也同樣證實(shí)：兩種方法的檢測(cè)陽(yáng)性率比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，且兩種方法檢測(cè)的結(jié)果具有高度的相關(guān)性，所以在沒(méi)有條件進(jìn)行FISH檢測(cè)的情況下，先進(jìn)行常規(guī)染色體核型分析也是必要的。

2.FISH技術(shù)對(duì)治療后患者M(jìn)RD的動(dòng)態(tài)檢測(cè)在治療后患者的隨訪過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)了3例MRD陽(yáng)性患者，在采取了相應(yīng)治療后全部轉(zhuǎn)陰。因此，我們認(rèn)為采用FISH技術(shù)在治療后早期發(fā)現(xiàn)MRD，并給予有效治療可以扭轉(zhuǎn)疾病的不良后果。

在動(dòng)態(tài)隨訪過(guò)程中檢測(cè)結(jié)果持續(xù)陰性的病人，臨床均未出現(xiàn)復(fù)發(fā)，說(shuō)明MRD的結(jié)果是監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的一個(gè)良好的指標(biāo)。3.FISH結(jié)果可以準(zhǔn)確反映白血病的治療效果我們選擇了3種國(guó)際公認(rèn)的白血病有效治療方案的患者，應(yīng)用FISH檢測(cè)他們?cè)谥委熐昂蟮腗RD值。結(jié)果反映治療前后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明治療效果明顯。這說(shuō)明FISH對(duì)MRD的檢測(cè)結(jié)果，能夠準(zhǔn)確反映白血病的治療效果。4.MRD與GVHD的相關(guān)性發(fā)生GVHD組與未發(fā)生GVHD的MRD比較差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。依據(jù)現(xiàn)有資料，我們尚不能認(rèn)為GVHD的發(fā)生與MRD值具有相關(guān)性。雖然國(guó)外有文獻(xiàn)證實(shí)兩者之間存在相關(guān)性，但考慮本研究中病例樣本量有限，還需要更大樣本的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。小結(jié)1.FISH檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)染色體核型分析結(jié)果基本一致，但FISH檢測(cè)速度更快、敏感性更高,且能夠檢測(cè)出部分常規(guī)染色體檢測(cè)不到或無(wú)法檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本。2.FISH對(duì)白血病患者M(jìn)RD的動(dòng)態(tài)檢測(cè)對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估白血病狀態(tài)，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，并指導(dǎo)臨床及時(shí)給予干預(yù)性治療具有重要意義。3．對(duì)3種治療方法的FISH檢測(cè)結(jié)果顯示：在治療后陽(yáng)性細(xì)胞率表現(xiàn)明顯減少，說(shuō)明FISH能夠準(zhǔn)確反映白血病的臨床治療效果。4．對(duì)移植后患者GVHD的發(fā)生與MRD的相關(guān)性分析表明兩者之間無(wú)相關(guān)性，但病例樣本不足，需要