一株產(chǎn)漆酶菌株的篩選與分離

一株產(chǎn)漆酶菌株的篩選與分離作者：范美霞，徐傳霞，李俊菊，蔡麗沙，馮慶文來源：《現(xiàn)代食品》2019年第24期范美霞，徐傳霞，李俊菊，蔡麗沙，馮慶文(荷澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東？荷澤?274000)FanMeixia,XuChuanxia,LiJunju,CaiLisha,FengQingwen(HezeInspectionResearchInstituteforFoodandDrugControl,Heze?274000,China)摘?要：產(chǎn)漆酶菌株與焦性沒食子酸反應(yīng)能產(chǎn)生棕褐色的變色圈，根據(jù)這一原理，從土壤中篩選出一株高產(chǎn)漆酶的菌株，并初步研究了溫度對(duì)漆酶活性的影響，結(jié)果表明50?60°C為其活性最強(qiáng)的溫度范圍。關(guān)鍵詞：漆酶；Bavendamm培養(yǎng)基；變色圈；真菌Abstract：Lacese-ProdueingmicrobialstainsreactwithBavendamm,theresponsegeneratedwithbrown,Throughthisprinciple,astrainscreenedfromsoilstrainsofhighyieldoflaccase,andapreliminarystudyoftemperatureeffectonthelaccaseactivity,theresultsshowthatbetween50?60Ctemperatureofitsmostactive.Keywords：Laccase;Bavendamm’smedium;Colorchangingring;Fungi中圖分類號(hào)：Q93漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，最早發(fā)現(xiàn)于日本漆樹的傷流液，廣泛存在于昆蟲、植物、真菌和細(xì)菌中［1-4］。漆酶能氧化各種酚類化合物、殺蟲劑等多種環(huán)境污染物，因而被廣泛應(yīng)用于造紙、印染、食品等工業(yè)。也正是因?yàn)槠崦该傅膽?yīng)用價(jià)值，故對(duì)該酶高產(chǎn)菌的分離篩選成為目前的研究熱點(diǎn)。從現(xiàn)有報(bào)道看，漆酶最主要來源于子囊菌和擔(dān)子菌亞門的高等真菌，特別是擔(dān)子菌中的白腐真菌［5］，這些菌也是目前報(bào)道最有效的芳香族類化合物的降解菌。但白腐菌一般生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，而且所產(chǎn)漆酶大多為誘導(dǎo)酶［6］，這些特性使工業(yè)生產(chǎn)難以有效進(jìn)行，故篩選生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)酶時(shí)間早的菌株具有十分重要的意義。由于漆酶應(yīng)用廣泛，高酶活菌株的篩選就顯得尤其重要。但目前，對(duì)漆酶菌株的篩選尚無簡(jiǎn)便可靠的方法，用液體發(fā)酵進(jìn)行初篩既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力；用木質(zhì)素降解菌的篩選方法，往往針對(duì)性較差，效果也不理想。為了尋找漆酶產(chǎn)生菌的初篩條件，筆者根據(jù)不同溫度對(duì)漆酶活性的影響，進(jìn)行了漆酶產(chǎn)生菌株初篩條件的研究，結(jié)果大大提高了初篩的工作效率，現(xiàn)將報(bào)告如下。1?實(shí)驗(yàn)原理Bavendamm平板法是通用的漆酶產(chǎn)生菌初篩方法，其原理是利用菌株分泌的漆酶能使Bavendamm平板中的鞣酸等酚類化合物聚合因而在菌落周圍形成棕褐色輪環(huán)顯色圈的性質(zhì)，根據(jù)顯色圈的直徑大小和產(chǎn)生時(shí)間可判斷其產(chǎn)漆酶性能。2?材料與方法2.1?實(shí)驗(yàn)樣品土壤采樣。采集帶有腐爛楊樹葉的底下5?15cm深的土壤，三點(diǎn)采集，每份樣品重約5g，編號(hào)樣品1?7。從楊木堆中分離篩選。取感染有真菌的木頭，用小刀撬取一小塊接種在選擇培養(yǎng)基平板上，取3份樣品，編號(hào)樣品8?10。2.2?培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉18g、KH2PO43g、MgSO4?7H2O1.5g，pH自然(約6.0)，加水至1000mL，121°C滅菌20min。倒平板后備用。Bavendamm培養(yǎng)基。馬鈴薯培養(yǎng)基中加入終濃度為0.03%的焦性沒石子酸(鞣酸)。2.3?試驗(yàn)步驟2.3.1?產(chǎn)漆酶菌株的初選在無菌環(huán)境下將樣品1?7研碎，10倍稀釋成不同濃度的樣液。吸取各梯度樣品懸液0.1mL，均勻涂布于Bavendamm培養(yǎng)基上，每濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)，置于28C恒溫培養(yǎng)，每24h觀察一次，選出平板上出現(xiàn)明顯棕褐色變色圈的單菌落菌株，有棕褐色輪環(huán)者記為+，反之記為-，根據(jù)所產(chǎn)褐色圈的大小，選出產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)的微生物菌株，并記錄顯色時(shí)間［6-8］。在無菌條件下將樣品8?10研碎，均勻地曬在Bavendamm培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)重復(fù)，置于28C恒溫培養(yǎng)，每24h觀察一次，選平板上出現(xiàn)明顯褐色變色圈的單菌落菌株。記錄菌落周圍有無褐色輪環(huán)產(chǎn)生，有棕褐色輪環(huán)者記為+，反之記為-，根據(jù)所產(chǎn)褐色圈的大小，選出產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)的微生物菌株，并記錄顯色時(shí)間［6-8］。2.3.2?產(chǎn)漆酶菌株的復(fù)篩復(fù)篩漆酶活性的檢測(cè)可根據(jù)Bavendamm的方法進(jìn)行，由于培養(yǎng)基中加入一定量的愈創(chuàng)木酚，含有漆酶的菌株在這特定培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌絲能產(chǎn)生明顯的橘紅色。用Bavendamm方法能判斷菌株有無漆酶，而且根據(jù)變色圈顏色深淺能大致分析出試驗(yàn)菌株含有漆酶活力高低。對(duì)培養(yǎng)過程中每天變色圈和菌絲圈尺寸大小和變色圈顏色深淺變化進(jìn)行分析，篩選出1株產(chǎn)漆酶較高的菌株，編號(hào)為菌株1，此菌株作為進(jìn)一步研究的試驗(yàn)菌株。挑選出現(xiàn)棕褐色變色圈的單菌落進(jìn)行打孔，使用直徑5mm的打孔器。將打孔下來的菌片接種到PDA培養(yǎng)基上的菌株置于28C的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)到直徑5cm左右進(jìn)行打孔轉(zhuǎn)接。2.3.3?產(chǎn)漆酶菌株的鑒定將上步的菌株打孔轉(zhuǎn)接到馬鈴薯培養(yǎng)基上，至于28C恒溫培養(yǎng)。在打孔過的平板的孔隙內(nèi)加入0.1%的焦性沒食子酸溶液，置于28C恒溫箱中，每12h觀察平板底部顏色的變化。將棕褐色變化最深的菌株打孔10份，編號(hào)為1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4-1、4-2，5-1，5-2,接種到馬鈴薯培養(yǎng)基上。置于28C中培養(yǎng)。然后挑取在PDA平板上的菌絲制成菌懸液，于顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)。2.3.4?產(chǎn)漆酶速度的鑒定待菌落的直徑長(zhǎng)到5cm左右時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基打孔，在打孔的培養(yǎng)基的孔隙中滴入4滴0.1%的焦性沒食子酸溶液，分別放入28、37、50.60°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔30min進(jìn)行觀察。尋找最先出現(xiàn)棕褐色變化的樣品，并記錄產(chǎn)生棕褐色的時(shí)間。3?結(jié)果與分析3.1?初篩結(jié)果在10個(gè)采集的試驗(yàn)樣品中，有3個(gè)樣品疑似含有產(chǎn)漆酶菌株，并且菌落的大小都不相同，菌落的顏色為棕紅色，對(duì)疑似區(qū)域用小號(hào)打孔器進(jìn)行打孔轉(zhuǎn)接到馬鈴薯培養(yǎng)基上。對(duì)采集的樣品培養(yǎng)72h后觀察結(jié)果如表l表示，變色圈形態(tài)如圖1所示。目片I。鼎｝朋柏際朋*1幫曲的I。I I Q II IJ。M E I d M M t3.2?復(fù)篩結(jié)果將打孔的菌落接種在馬鈴薯培養(yǎng)基上，在28C恒溫培養(yǎng)后72h較大的單菌落，對(duì)菌落打孔轉(zhuǎn)接后置于28C中，在孔隙中加入4滴0.1%的焦性沒食子酸溶液，24h觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有3株菌落有棕褐色變化，并且顏色變化不同，結(jié)果如圖2所示。戲M41^JfcB ；ni=JfcnL*上1-j!m-i*nesbmm3.3?漆酶菌株的形態(tài)鑒定經(jīng)顯微鏡檢測(cè)，該菌菌絲體為絲狀，具有隔膜，有鎖狀聯(lián)合，細(xì)胞為多核結(jié)構(gòu)，符合漆酶的特征（圖略）。3.4?產(chǎn)漆酶菌株的快速篩選將培養(yǎng)的平板打孔，每個(gè)孔隙中加入4滴0.1%焦性沒食子酸溶液，分別置于28、37、50、60°C的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)，每間隔30min觀察一次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50C最先出現(xiàn)顏色變化，其次是60C，最后是37C和28C。表明漆酶的最適溫度在50?60C。在50C反應(yīng)4h，結(jié)果如圖3所示。囹J耳愕直于知,。情罪的蜻果圖4?結(jié)論通過平板顯色法從土壤中篩選出一株高產(chǎn)漆酶的菌株，并初步研究了溫度對(duì)漆酶活性的影響，初步測(cè)得該菌株所分泌的漆酶發(fā)揮活性的最適溫度在50?60C，對(duì)于該酶有關(guān)理化性質(zhì)還在進(jìn)一步的研究中。參考文獻(xiàn):[1]BaldrianP.Fungallaccases-occurrenceandproperties[J].FEMSMicrobiologyReviews，2006，30(2)：215-242.MayerAM，StaplesRC.Laccase：newfunctionsforanoldenzyme[J].Phytochemistry，2002，60(6)：551-565.DalfardAB，KhajehK，SoudiMR，etal.Isolationandbio-chemicalcharacterizationoflaccaseandtyrosinaseactivitiesinanovelmelanogenicsoilbacterium[J].EnzymeandMicrobialTechnology2006，39(7)：1409-1416.黃？俊，王行國.Klebsiellasp.601細(xì)菌漆酶的鑒定及性質(zhì)[J].化學(xué)與生物工程，2006,23（3）：31-34.[5]王佳玲，余惠生，付時(shí)雨，等.白腐菌漆酶研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，1998,25（4）：233