腫瘤學(xué)石豐榕修改

ApoG2及聯(lián)合放射治療誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-細(xì)胞凋亡與自噬的研導(dǎo)師：汪森明教授研究背景鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的[1]。它的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)及治療都與其他頭頸部腫瘤有明顯的區(qū)別[2]。全世界每年約有80,000例新發(fā)鼻咽癌患者，其中男女比例約為2.3:1[3]。南方及東南亞較為嚴(yán)重，尤其中國南方每年約有20/100,000新發(fā)病例[4]。它是我國南部最常見的惡性腫瘤之一。鼻咽癌發(fā)病曲線由20歲開始上升，至50-60歲的組達(dá)最高。病理類型以低分化鱗癌為主。主要通過淋轉(zhuǎn)移至頸淋，亦可通過血液轉(zhuǎn)移至骨、肺、肝。放射治療是其主要治療。對于早、中期患者，放療效果明顯，5年生存率>80%[5]。雖然早期放療可以取得滿意的效果，但隨著病變的進(jìn)展30%～40%患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)[6]。而且早期發(fā)現(xiàn)，患者就診時caspase參與，染色質(zhì)凝聚和外周化、細(xì)胞質(zhì)減少、核片有著重要的主要。細(xì)胞自噬是不依賴caspase參與，以細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)變性壞死的細(xì)胞器或胞漿蛋白形成自噬小體，后被溶酶體分解清除。Bcl-2在凋亡過程中的作用中有著重要的作用。Bcl-2蛋白作為主要調(diào)控凋亡的蛋白，調(diào)控著細(xì)胞凋亡。近來有研究表明[11]，凋亡與自噬相互作用，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞。響自噬的發(fā)生[13]。Bcl-2的自噬可能與自噬相關(guān)Beclin1有關(guān)。Bcl-2蛋白能與Beclinl蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，BH3的類似物能競爭性對抗Clay等研究發(fā)現(xiàn)[]，EB中有一個放的閱讀架與Bc-2有源性，稱作H，它與Bc-2相似，能夠人與鼠的淋巴細(xì)胞中由于生長因子缺引。B還源性c-2揮凋作用[1]，而后證實，該含有額外的，能夠間接地在細(xì)胞中引起B(yǎng)cl-2的反轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且利用c-2宿主細(xì)胞的凋亡。同樣在enesn和Seg分別發(fā)現(xiàn)EB潛伏期表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)P1和BR1能通過上調(diào)B2和C-1的水平來保護宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡[7,1]。Sog等發(fā)現(xiàn)c-2在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁非癌組織和炎性組織]現(xiàn)在鼻咽癌中c-2陽性表達(dá)率高達(dá)820]。因此靶向B2治療鼻咽癌，同樣有著雙萘醛類化合物。棉酚在領(lǐng)域最初以醋酸棉酚作為臨床應(yīng)用多年，近來研究表明其作為一種新型Bcl-2的小分子阻斷劑，在多種腫瘤中明研究目的CNE-2細(xì)胞的體外、體內(nèi)生長抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬現(xiàn)象ApoG2對人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞放射治療增敏作用，協(xié)同誘導(dǎo)發(fā)生凋亡與自噬現(xiàn)象及探討其可能作用機制。為ApoG2實驗方法CNE-2IC50CCK-8ApoG248hCNE-2q癌細(xì)胞系CNE-2后引起的凋亡形態(tài)變化；實驗結(jié)果CCK-8法體外增殖實驗檢測顯示濃度分別5、10、20、40、60（F=1819.354P=0.0001作用濃度越大，ApoG2=202.54，P=0.000細(xì)胞的抑制率升高。計算ApoG2在作用72hCNE-2細(xì)胞的IC50值為（F=2726.28，P=0.000，ApoG2（F=4316.28，P=0.000P=0.000Hoechst33258ApoG2的正常細(xì)胞核。ApoG2吖啶橙熒光染色法觀察，ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞48h，對照組細(xì)胞的胞核與胞質(zhì)呈亮綠色熒光，ApoG2及聯(lián)合放射治透射電鏡檢測可觀察到，ApoG2作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞48h，對照組的人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞形態(tài)良好，藥物組（ApoG240μmol/L）的CNE-2細(xì)胞體內(nèi)Flowcytometry（FCM）檢測凋亡率顯示，ApoG2用于人鼻咽癌CNE-248h，對照組凋亡率為(3.90±0.34ApoG（40μmol/L）F=485.294P=0.000（F=19.11P=000（P<0.05FCM40μmol/LApoG2（40μmol/L）(28.24±7.35)%Westernblot40μmol/LApoG2作用后人鼻咽癌CNE-（F=68.909，P=0.001Beclin1（F=497.906，P=0.000（F=69.248,P=0.000Beclin1（F=111.591,P=0.000，聯(lián)合作用組與其他三組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05稱量腫瘤重量后，計算腫瘤抑制率為65.49%，與對照組比較，治療后腫瘤體重實驗結(jié)論ApoG2在體內(nèi)外可以抑制人鼻咽癌細(xì)系CNE-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬發(fā)生程序性細(xì)胞。ApoG2還能增加人鼻咽癌細(xì)系CNE-2細(xì)胞對放射治療的藥物作用于Bcl-2，引起B(yǎng)cl-2表達(dá)下調(diào)，誘導(dǎo)Bcl-2途徑細(xì)胞凋亡，同時Bcl-2蛋白表達(dá)下降，間接減少Bcl-2蛋白與Beclin1蛋白結(jié)合的機會，能夠使：棉酚鼻咽癌放射敏感性凋亡自噬ApoG2aloneorcombinedwithradiotherapyinducesapoptosisandautophagyinnasopharyngealcarcinomacelllineCNE-2.Name:ShiKEYWORDS:Nasopharyngealcarcinoma；Apogossypolone；radiosensitivity；Apoptosis；AutophagyNasopharyngealcarcinomaisamalignanttumorthatoccursinnasopharyngealmucosaepithelialcells.Itsoccurrence,development,clinicalmanifestationsandtreatmentisdifferentfromthoseofotherheadandneckcancers.Thereareabout80,000newcasesofnasopharyngealcarcinomapatientseachyearworldwide,withamaletofemaleratioof2.3:1.ThesituationinsouthernChinaandSoutheastAsiaismoresevere,especiallyinsouthernChinawith20newcasesevery100000reportedeveryyear.Itisoneofthemostcommonmalignanttumorsinsouthernchina.Theincidenceagecurveofnasopharyngealcarcinomastartsincreasingfromof20,peakingatgroupof50-60yearsold.Themostcommonpathologicaltypeislowdifferentiatedsquamouscarcinoma.Itmetastasizesmainlythroughthelymphnodetothecervicallymphnode,orthroughthebloodstreamtothebone,lung,andliveraswell.Radiotherapyisthemaintheruticmethodthatbenefitsmostlyfortheearly,mid-termpatients,withasurvivalrateof5yeargreaterthan80%.30%～40%patientswillshowdistantmetastasisandlocalrecurrencewiththedevelopmentoflesions,thoughearlyradiotherapycanachievesatisfactoryresults.Atthetimepatientsarediagnosed,multiplecervicallymphnodemetastasesarecommona,pmgthembecauseofthedifficultiesinearlydiagnosis.Inthediagnosisofnasopharyngealcarcinomapatients,about70%patientshavestageⅢandⅣcancersandhaveapoorprognosis.Forthoseadvancednasopharyngealcarcinomachemotherapy-basedcomprehensivetherapyareadministered.Althoughcombinationtherapiesalleviatepatients,itconfersradiotherapyandchemotherapy ,andsideeffectsheavier.Theoverall5yearsurvivalrateisabout50%.Therefore,weneedtocontinuetostudythepathogenesisofnasopharyngealcarcinomainordertoseekforbetterwaysinthetreatmentofnasopharyngealcarcinoma.Mostofthetumortreatmentssuchaschemotherapy,radiotherapyandbiological escancersbyinducingtumorcellapoptosis.Apoptosisisaformofprogrammedcelldeath,thatis,undercertaininternalandexternalsignaltransduction,relyingoncaspaseparticipation,thechromatinandcytoplasmiscondensed,nuclearfragmentationandthecytoplasm,cellshrinkageis posedintoapoptoticbody,beswallowedupbytheneighboringcellsormacrophages.Recentfindingsshowedthatautophagy,anotherformofprogrammedcelldeath,playsanimportantroleintumorigenesisanddevelopment.Notdependentontheinvolvementofcaspaseincells,autophagyinvolvestheformationofadoublemembranearoundtheanelleorcytosolicproteinwithinthecellknownasanautophagosome,whicharethenfusedwithlysosomesanddegradedorrecycled.Bcl-2familyplaysanimportantroleinapoptosis.TheBcl-2familyproteinasthemainproteinsregulatingapoptosisregulatescellapoptosis.Recentstudiesshowthatapoptosisandautophagyinteracttopromotecelldeath.Ithasbeenshownthat,Bcl-2overexpressioncaninhibitautophagy.Bcl-2couldinduceapoptosisandinfluenceautophagy.Bcl-2inducedautophagymightberelatedtoautophagygeneBeclin1.BH3oguescouldcompetewithTheBcl-2proteintobindBH3inbeclin1,resultinginthereleasingofBeclin1topromoteautophagy.Therefore,studiesoningbcl2,inducingtumorcellapoptosisandautophagy,inhibitingtumorproliferation,isatopicworthyofstudy.Cleary,etc.Studieshavefoundthat,EBhasanopenreadingframehomologoustotheBcl-2gene,calledBHRF.SimilartotheBcl-2,itcanpreventthelymphcellsofmiceandhumanfromapoptosisduetothelackofgrowthfactor.EBcanalsomediateendogenousBcl-2expression,therebyinhibitingcellapoptosis.ItwasconfirmedthatthecontainsadditionalgenesthatcanindirectlycausetheBcl-2expression,anduseBcl–2proteintoinhibithostcellapoptosis.Inaddition,HendersonandShengfoundthatinEBlatentinfectionperiod,expressionofLNP1andBARF1canupregulatetheexpressionofBcl-2andMCL-1toprotecthostcells,preventinghostcellapoptosis.SongetalfoundthattheexpressionlevelofBcl-2innasopharyngealcarcinomatissueswashigherthanthatinadjacentnon-canceroustissuesandinflammatorytissue.LiuyunetalfoundexpressionrateofpositiveBcl-2wasashighas82%innasopharyngealcarcinoma.ThereforeedtheBcl-2genetherapyofnasopharyngealcarcinoma,alsohasimportantsignificance.Gossypolisakindofyellowdoublenaphthalenehydroxylpolyphenolaldehydecompoundsextractedfromthecottonstalk,leaf,seedandroot.Gossypolacetateatinthemedicalfieldasamalecontraceptiveclinicalapplicationformanyyears,andrecentstudiesshowedthatasasmallmolecularmodelBcl-2blocker,itexhibitedsignificantantitumoractivityinavarietyoftumors.Apogossyplone(ApoG2),anewtypeofgossypolderivativessynthesizedbyremovinoaldehyde,showsnotonlylowtoxicsideeffects,butalsoawidevarietyofanti-tumoreffect,showingabetterprospectofapplication.ThisexperimentfocusonhighBcl-2expressionnasopharyngealcarcinomacellsCNE2astheresearchobject,tostudyApoG2‘sinhibitionandinductionofcellapoptosiseffectinCNE-2cellsinvitroandinvivo,andpreliminarydiscussiononthepossiblemechanismofaction.Atthesametime,radiosensitizingeffectofApoG2intheCNE-2celllinebyactivatingapoptosisandautophagywasobserved,anditsmechanismwasinvestigated.Toprovideexperimentalbasisforfurtherstudy,andlayatheoreticalfoundationforApoG2’sclinicalapplication.toutilizeCCK-8invitroproliferationassaytomeasureeffectsofApoG2onCNE-2cellsafter24h,48hand72h,andcalculatetheIC50;ToutilizeCCK-8invitroproliferationassaytomeasureeffectsofApoG2combinedwithradiotherapyonCNE-2cellsafter48handcalculatetheqvalue;ToobserveapoptoticmorphologicalchangesofApoG2aloneorcombinedwithradiotherapyinCNE-2cellsthroughHoechst33258fluorescentstainingToobserveMorphologicalchangesofautophagyofApoG2monotherapyandcombinedwithradiotherapyinnasopharyngealcarcinomacelllineinducedbyCNE-2byAcridine-orange(AO)staining;Transmissionelectronmicroscopy(TEM)wereemployedtoobservemorphologicalalterationsinautophagiccellsaftertreatmentofApoG2cellultrastructureinCNE-2cells.；6．FlowcytometrywasusedtodetectthechangesofapoptosisrateandcellautophagyratefortheApoG2aloneorincombinationwithradiotherapyeffectinCNE-2cells;WesternblotexperimentsdetectchangesofexpressionoftheBcl-2proteinandBeclin1proteinafterApoG2single-agentandcombinedwithradiotherapyonCNE-2cells;CopymodelofCNE-2nasopharyngealcarcinomainnudemiceandobservetumrowthinhibitionofApoG2invivo.TheCCK-8assayshowedthatthetreatmentresultedindose-andtime-dependentinhibitionofcellproliferationwhenwetreatedCNE-2cellswith5,10,20,40,60,and80μMApoG2for24,48and72h.Withincreaseddrugconcentrationorprolongedtime,theinhibitoryactionofApoG2onCNE-2cellswas （Fcencentration Pcencentration=0.000.Ftime=2041.671，Ptime=0.000）.Andthereisinteractionbetweenconcentrationandtime(F=202.540,P=0.000).The50%inhibitoryconcentration(IC50)ofApoG2for72hwas23.61μmol/L.TheexposuretothecombinationApoG2withradiationfor48h,resultedinradiationdose-andconcention-dependentinhibitiononCNE2cells.ApoG2combinedradiotherapyCNE-2cells48h,canseethecomparisonbetweendifferentdosehassignificantdifference(F=2726.28,P=0.000),ApoG2incomparisonalsohasasignificantdifferencebetweendifferentdrugconcentrations(F=4316.28,P=4316.28).Theinteractioneffectbetween(F=18.54,P=0.000).Computingjointqvalue>1.15,ApoG2andradiationcombinedapplicationwithsynergy.Comparedwiththecontrolgroup,Hoechst-33258stainingdemonstratedtheoccurrenceofapoptosisintheCNE-2cellstreatedwithApoG2orradiotherapy,orcombination.However,themorphologicalchangesinthenuclearcondensationandfragmentationininCNE-2cellstreatedbyapo-G2combinedwithradiotherapyweremostsignificant.ApoG2aloneorincombinationwithradiotherapygroupshowedobviouspyknosis,fragmentation,chromatincondensation,formationofapoptoticbodiesandapoptoticfeatures,whileinthecontrolgroupcellchromatinevenly,morphologicalrulesnuclearpalebluenormalnucleuswereshown.Moreapoptosiswereobservedincombinedtreatmentgroup.AOstainingrevealedmorebrightredacidicvesicularanellesinthecombinationgroup.TheruticeffectsofApoG2monotherapyandcombinedwithradiotherapyonCNE-2cells48h,cellnucleusandcytoplasmincontrolcellsshowedbrightgreenfluorescence,ApoG2andcombinedradiotherapygroupcytoplasmornucleusofacidicautophagosomewasdyedbrightredfluorescence,combinedradiotherapygrouproleinautophagyphenomenonmoreobvious.Anincreaseinthenumberoflargevacuolesanddouble-layeredmembranestructurewasobservedunderTEMinthecombinationgroup.ItwasobservedthatthetheruticeffectsofApoG2monotherapyandcombinedwithradiotherapyonCNE-2cellsin48hbyTransmissionelectronmicroscope,thatdruggroup(ApoG240μmol/L)aftertreatmentwith48hinCNE-2cells,largevacuolesincreased,andmultiplescatteredinthemembranebilayerstructureandotherfineautophagyphenomenonappears,whilethecontrolgroupofCNE-2cellshavegoodFlowcytometry(FCM)todetectapoptosisrateshowedthatApoG2single-agentandcombinedradiotherapyeffectsonCNE-2cells48h,thecontrolgrouptheapoptosisratewas(3.90+0.34)%,ApoG2groupis(19.52+1.18)%,thedifferencewasstatisticallysignificant(F=485.294,P=0.000);Controlgroup,ApoG2singlemedicinegroup,thesimpleradiotherapygroupandcombinedradiationtreatmentgroup,theapoptosisratestatisticallysignificantmeandifferencesbetweengroups(F=149.511,P=149.511),thejointactiongroupcomparedwiththeotherthreegroupswerestatisticallysignificantdifference(P<0.05),thetwodrugsincombinationwiththeapoptosisrateishigher.ExaminationoftheFCMshowedthatautophagyfluorescenceintensityforthecontrolgroup(0.92+3.10)%,(28.24+7.35)%for40apog2group,thedifferencewasstatisticallysignificant(F=31.035,P=0.003),ApoG2groupishigherthanthecontrolgroup.WesternblotresultsshowedthatCNE-2cellstreatedwith40umol/LofApoG2resultedinreducedtheBcl2proteinexpressionthanthecontrolgroup(differencesstatisticallysignificant(F=68.909,P=0.001));Beclin1proteinexpressionincreased,comparedwiththecontrolgroup(differencesstatisticallysignificant(F=497.906,=497.906)).Incombinedradiotherapyexperiments,theBcl-2proteinexpressionrelativetotheamount,statisticallysignificantmeandifferencesbetweengroups(F=69.248,P=69.248),andcombinedwithotherthreegroupswasstatisticallysignificant(P<0.05),thejointgroupofBcl-2proteinexpressionofthetyislower.Beclin1proteinrelativeexpression,statisticallysignificantmeandifferencesbetweengroups(F=111.591,P=111.591),thejointactiongroupcomparedwiththeotherthreegroupswerestatisticallysignificantdifference(P<0.05),thejointgroupofBeclin1proteinexpressionofthehigherty.Transplantationtumorexperimentinvivoshowedthatafterbeingadministeredwiththedrug12days,striptumor,afterweighingthetumor,thetumorinhibitionratewas65.49%,comparedwithcontrolgroup,tumorweighthadsignificantdifferencesaftertreatment,P<0.05).Noadversereactionsoccurinnudemiceduringwholeexperimentperiod.Accordingtotheevaluationcriteria:thetumorgrowthinhibitionrate<40%,ineffective;Thetumrowthinhibitionrateof40%orhigher,andP<0.05iseffective.WebelievethatApoG2couldsignificantlyinhibittheproliferationofCNE-2cellsinvivo.ApoG2caninhibittheproliferationofCNE-2cellsandinduceapoptosisandautophagicprogrammedcelldeathinvitroandinvivo.ApoG2c soincreaseCNE-2cells’sensitivitytoradiationtherapy,promotetheoccurrenceofapoptosisandautophagy,andsynergisticallyinhibittumorcellproliferation.ThecombinedapplicationofApoG2andceramideatlowerconcentrationspromotesapoptosisandautophagy,andsynergisticallyinhibitstheproliferationofhumannasopharyngealcarcinomacells.Sucheffectsmayberelatedtothedown-regulationofBcl-2expressionandtheup-regulationofBeclin1expression.Me,adecreaseinBcl-2expressiondisturbeditsbindingwithbeclin1,resultinginmoreliberatedbeclin1proteinandpromotingauphagy 前 第一部分棉酚衍生物誘導(dǎo)鼻咽癌E-2細(xì)胞凋亡與自噬及其機制的探 材料與方 結(jié) 3第二部分聯(lián)合放射治療誘導(dǎo)鼻咽癌E-2細(xì)胞細(xì)胞凋亡與自 材料與方 結(jié) 3.全文總 參考文 附錄：縮略語和中英文對照 在讀期間情 致 南方醫(yī)學(xué)性前樣腫瘤防治發(fā)布的《中國腫瘤報告》中，鼻咽癌的率是1.46/10萬，分類構(gòu)成中由20世紀(jì)90年代的第8位下降為目前的第13位，鼻咽癌排第10位，女性排第16位，率是女性590%潛在異常生長的細(xì)胞，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。其主要形態(tài)學(xué)特征是：細(xì)胞的體積縮小，連接，細(xì)胞質(zhì)密度增加，核質(zhì)濃縮，核仁破碎，DNA降解，最終形析（AnnexinⅤ法）與碘化丙啶（propidineiodide，PI）拒染法聯(lián)合分析，可將早晚期凋亡細(xì)胞以及壞死細(xì)胞區(qū)分出來。Caspase酶活性檢測，TUNEL法（脫氧核核甘酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法，以及凋亡相關(guān)特異表達(dá)水 過雙層膜來受損的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)，然后在細(xì)胞骨架的作用下輸送到溶酶Bcl-2蛋白跟凋亡關(guān)系密切。目前鑒定出了近20種Bcl-2蛋白成它們是Bcl-2,Bcl-xL,Mcl-1,Bcl-w,A1,Boo和Ced-9等成員;另一類是促凋亡蛋白，他們是Bax,Bad,Bak,Bim,Bik,Bid,Bcl-xS,Blk等[28]。在結(jié)構(gòu)這些保守的結(jié)構(gòu)域即BH1, BH3及BH4。Bcl-2抑凋亡蛋白包含BH1-4四個保守結(jié)構(gòu)域。BH3結(jié)構(gòu)是促凋亡活性必不可少的部分；BH4則是抗凋亡必不可缺少的部分[29]。Bcl-2蛋白的促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間可通過這4個結(jié)構(gòu)域形成同/異二聚體，它倆的相對濃度比值決定細(xì)胞的生死命運。Bcl-2和Bax蛋白是最具代表的抑凋亡和促凋亡蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，從Bcl-2蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)看，膜結(jié)合部的BH1、BH2及BH3構(gòu)成一個疏水溝，Bax等蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域能形成α螺旋疏水溝中，形成異二聚體來抑制Bcl-2蛋白作用。BH3是介導(dǎo)形成異二聚體來開啟促凋亡活性的重要結(jié)im、Bik和Bid只有BH3結(jié)構(gòu)域，但是卻是促凋亡蛋白。Bcl-2抗凋亡的機理主要包括以下4個方面。1是直接或者間接地細(xì)胞色素來發(fā)揮抗凋亡的作用；2是通過細(xì)胞凋亡信號傳遞來起到抗凋亡的作用;3是抑制Ca2+的來引起抗凋亡的作用；4是通過抑制活性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生來誘導(dǎo)抗凋亡的作用。近來研究也顯示Bcl-2在非凋亡性細(xì)胞中具有重要意義。Bcl-2能通過自噬蛋白Beclin1與自噬關(guān)系密切。Beclin1是最早發(fā)現(xiàn)的控制自噬性的基因。它位于人17q21上，能編碼一個含有450個氨基酸分子量為600KDBeclin1Bax、bakBH3依賴的自噬和Beclin1依賴的自噬性[33]。研究表明Beclin1與抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合可抑制自噬發(fā)生并誘導(dǎo)腫瘤形成[34]。酶蛋白抑制劑則不能細(xì)胞[36]。3是自噬與凋同作用，從而促進(jìn)細(xì)胞兩者是相互補充，相互促進(jìn)的。Kanvazawa等研究用三氧化二砷作用膠質(zhì)瘤發(fā)故選用人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞作為研究對象，主要探討ApoG2單藥及聯(lián)合放射第一部分棉酚衍生物ApoG2咽癌CNE-2胞凋亡與材料與方材料與主要ApoG2由密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤中心徐梁教授惠贈，用二甲基亞（3）25cm2培養(yǎng)瓶、75cm2培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔板NEST15ml離心管、50ml離心管為Corning公司產(chǎn)品。（4）H-DMEMEDTA0.25%胰蛋白酶溶液、PBS科技；吖啶橙（Acridineorange，AO）SigmaRIPAPMSF及BCA蛋白定量試劑盒購置于申能生物公司產(chǎn)品，預(yù)染蛋白MarkerFermentas公司產(chǎn)品，5×上樣緩沖液為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品，beta-actin購置于艾比瑪特公司產(chǎn)品，抗Bcl-2抗體購置于SantaCruzBeclin1SantaCruz二抗購置于博士德公司產(chǎn)品，PVDF膜購置于Millipore公司產(chǎn)品，粉、定影粉均購置于廣州威佳科技產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純。方細(xì)胞培從液氮中取出所需人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株的凍存管，迅速放置于37℃水浴入5ml含10%滅活胎牛、1×青鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)液中，輕輕吹打洗滌細(xì)胞，離心去除廢液；再向離心管中加入10ml含10%滅活胎牛、100U/mL青霉100μg/mLH-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入含EDTA0.25%胰蛋白酶溶液，鋪滿瓶底，置入培養(yǎng)箱中孵育消化細(xì)胞5-71000rpm5min，去廢液，再加入適量的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：4～1：5傳代，試驗均取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。CCK-8ApoG2取對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞，按照上述步驟消化細(xì)胞，待細(xì)胞計數(shù)后，以1x105個／ml重懸細(xì)胞，每孔加入100μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸200μL24hApoG25、10、20、40、60和80μmol/L的含10%胎牛的H-DMEM培養(yǎng)液100μL，對照組加入含0.1%DMSO培養(yǎng)液100μL，空白對照設(shè)為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，每組424、4872h100μL新培養(yǎng)液及CCK-8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育1h。隨后酶標(biāo)儀測定450nm波長下各A3次，按照抑制率(%)=1－(A值-空白對AAA100%，分別計算各組的增殖抑Hoechst33258ApoG21.5×105624h50%～70%0.1%DMSO48h0.5mL63吖啶橙染色（Acridineorange，AO）觀察ApoG2用細(xì)胞后后，待細(xì)胞長滿瓶底（ApoG240μmol/L）及對照組（0.1%DMSO48h。吸盡舊驗重復(fù)3次。透射電鏡觀察ApoG2作用細(xì)胞后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)2×105個／mL，4mL48hEDTA0.251000r/min送電鏡室進(jìn)行固定、脫水、、、切片、染色，在透射電鏡下觀察細(xì)胞超F(xiàn)CM檢測ApoG2作用細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化后，按照細(xì)胞密度為2×105個／mL，接種4mL細(xì)胞懸液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞長滿瓶底50%～70ApoG2終濃度40μmol/L培養(yǎng)液4mL，對照組加入含0.1%DMSO培養(yǎng)液4mL，放置于培養(yǎng)48h。吸盡舊培養(yǎng)液，PBS1EDTA0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，計數(shù)細(xì)胞后，取5×105個細(xì)胞加入流式細(xì)胞管中，離心去上清，加入400μL的BindingBuffr重懸細(xì)胞；向流式細(xì)胞管中加入5μLAnnexinV-FITC混勻后，再往流式細(xì)胞管中加入5μL碘化丙啶(propidiumiodide，PI)10min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。FCM檢測ApoG215min，離心去上清，PBS3FLl-HeightFL3-Height熒光通道代表紅色熒光，F(xiàn)L3-Height3WesternBlottingApoG2Bcl-2、Beclin1來檢測樣品的方法。1975SouthernDNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DN段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。（10%～20%（blot測。印跡首先用蛋白溶液（10％BSA）處理以封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合，這樣去除未結(jié)合的一過氧化物酶可以以H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)2O2（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強劑存在下光強度可以增大1000倍，通過將印跡放5415R型低溫超速離心 EppendorfofNorth5810R型低溫離心機 EppendorfofNorthAmerica，USABio-rad電泳儀 Bio-Rad,USA電子分析天 eilPH ThermoOrion,-80℃醫(yī)用低溫冰 Bio-rad半干式轉(zhuǎn)膜 Bio-Rad,TMP-1型電子天 德國制Fs-1脫色搖床 Bio-RadModel680酶標(biāo)儀 Bio-Rad,USAEppendorfcentrifuge5451R GrantXB制冰 Grant,RIPA、PMSF及BCA蛋白定量試劑盒購置于申能生物公司產(chǎn)品；氯化鈉(NaCL)、溴化鉀(KBr)、硫酸銅(CuSO4)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉)、無水乙醇、疊氮化鈉(NaN3)均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；預(yù)染蛋白MarkerFermentas5×上樣緩沖液為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；beta-actinBeclin1抗體購置于SantaCruz公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶二抗購置于博州威佳科技產(chǎn)品。：液RIPA混合，充分搖勻置于冰上。來回?fù)u動30min，使細(xì)胞充解。1.5ml將含細(xì)胞碎片和裂解液的離心管移入提前開機預(yù)冷的離心機中，按照4℃,14000rpm離心20min。BCA工作液的配制：按50:1的體積混合后，充分混勻待用；據(jù)樣品的數(shù)目和蛋白質(zhì)的濃度，取適量的BCA試劑A液和B液，按每個反應(yīng)使用200μlSolutionA+4μlSolutionBA+B3個平行反應(yīng)?；旌弦盒枰?4小時內(nèi)用完；123456705505055000（ug/mle濾器過濾濃縮膠緩沖液（0.5mol/LTris·HCl）：70ml雙蒸水去離子水溶解分離膠緩沖液（1.5mol/LTris·HCl）：70ml雙蒸去離子水溶解10%過硫酸銨（APS）1ml0.1g4℃冰箱保存，保存時間為1。為方便操作，可先將過硫酸銨干粉稱好后，分裝于多個EP子水中，調(diào)整pH至8.3-8.7，蒸水定容至1000ml，室溫保存?zhèn)溆?。?.2L甲醇，最后蒸水定容至1L；HCl，pHpH7.4，a)玻璃板凝膠的按下 12%分離

5%濃縮膠去離子水 30%丙烯酰胺 1.5mol/LTris·（pH8.8（ml）0.5mol/LTris·（pH6.8（ml）

②按前面方法配制12％分離膠，加入TEMED后立即搖勻后灌膠。灌膠時，可用10ml注射器吸取5ml膠沿玻璃緩慢放出，待膠面升到中間線高度時即可。③當(dāng)水和膠之間有一條折射線時（室溫20℃左右時等待大約30min說明膠已凝了，再等3min使膠充分凝固后，倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。④按前面方法配制5％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻后灌膠。用5%的2020min)，兩手捏住梳子的樣品處理：從-80℃冰箱中取出準(zhǔn)備好的樣品移入200μl的EP于冰上，按比例加入5×SDS上樣緩沖液，4℃離心1min，將EP管壁上的液體甩EP5min使蛋白變性，取出置于冰上。上樣電泳：適量各組樣品依次加入各個加樣孔中（上樣總體積一般不超過15μl），接通電源，將電壓調(diào)至80V，當(dāng)前沿進(jìn)入分離膠后，電壓改進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（如果目的條帶比較大的話，最好使用可視的蛋白marker，一般要讓目的條帶跑過分離膠的1/3比較好。斷開電源，從電槽中取出玻板并地撬定SDS膠/PVDF膜疊層和施加電場的機械裝置不同。壓。濕轉(zhuǎn)法有效，適用于各種分子量的蛋白，尤其是分子量＞150kDa的蛋白。②半干轉(zhuǎn)法用緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因為電極板直接與濾SDSPVDF60kDa42-43kDa，戴手套將膠割至合適大小，并用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡5min×3次。準(zhǔn)備6張7.0-8.3cm的濾紙和1張7.3-8.6cm的PVDF膜，戴手套切濾紙和膜與膠條同樣10min，PVDF1minPVDF膜。轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、陰極碳75mA1h。注意轉(zhuǎn)移液中含甲醇，操作時需要戴手套、，保持空氣流通。封閉：漂洗后將PVDF膜放入加有5%脫脂奶粉的平皿中，4℃封閉過夜或常溫封閉1h。TBST1:500Bcl-2體，將PVDF膜放入加有一抗的袋中，標(biāo)志后置于擺搖床室溫低速孵育2h次，每次10min。顯色，其基本原理為：魯米諾(Luminol)是過氧化物酶的底物。NovexECLX光片感光并經(jīng)顯影、定影從而記錄下來。目前WesternBlot的顯色方法主要有ECL底物化學(xué)發(fā)光和底物DAB呈色。ABHRPLuminol1000X多次壓片，以達(dá)到最佳效果；結(jié)束后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速移入顯影液中顯影，顯影液要完全浸過X-光片，待出現(xiàn)明顯條帶后，立即終止顯影。顯影結(jié)束后，馬上把X-光片移入定影液中，使膠片變透明為止。取出膠Strip6.7，700u（方法同前鼠實驗觀察ApoG2移植瘤的抑制情(1)動物 動物飼養(yǎng)條件：鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)動物實驗中心，SPF級環(huán)境，有動物飼養(yǎng)合格。(2)鼠移植瘤模型的構(gòu)于接種細(xì)胞第3天，腫瘤體積長越50mm3大小時，隨機分為兩組，每組5120mg/kgApoG2藥物，對照組隔天腹腔接種0.2ml鹽水。隔天觀察動物一般情況，精神狀態(tài)，有無營養(yǎng)不良，有無、惡液質(zhì)出現(xiàn)，測量移植瘤的體積，鼠體重，參考文獻(xiàn)[55]，按照公式V=長×寬2/2當(dāng)對照組鼠移植瘤大于1cm3時，終止實驗。斷頸處死鼠，取出腫瘤，統(tǒng)計方采用SPSS13.0統(tǒng)計進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差S)One-WayANOVA較在方差齊性時用Bonferroni方法，方差不齊性時用DunnettT3方法。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)CCK-8檢測ApoG2對CNE-2細(xì)胞的生長抑制作1F=1819.354P=0.000（F=04.671P0000=202.540P=0.000合 F P合 F P 40.87±15.97 53.68±21.89 66.41±29.34 合31.17±26.981819.354*F P 圖1- 不同濃度 E-2細(xì)胞24和48及72h的增殖抑制作Fig.1-1InhibitioneffectsofApoG2atdifferentconcentrationsonCNE-2cellsfor24,48 熒光染色觀察 對E-2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影2;圖1-2 染色觀 誘導(dǎo)E-2細(xì)胞凋亡變化Fig.1-2MorphologicalchangesofCNE-2cellstreatedwithApoG2(Hoechst33258吖啶橙（AO）熒光染色觀察對E-23;圖1- 熒光染色觀 誘導(dǎo)E-2細(xì)胞自噬變化Fig.1- MorphologicalchangesofCNE-2cellstreatedwithApoG2(AOstaining,透射電鏡觀察對E-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變藥物組用含ApoG2濃度為40umol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞48h，與此對0.1%DMSOCNE-248h，透射電鏡觀察到與對照組相比，可見細(xì)胞體內(nèi)大空泡增多，多個散在的膜性雙層結(jié)構(gòu)（1-4。 ;1-4透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure1-4MorphologicalchangesofApoG2actonCNE-2cells,byTransmissionelectron檢測對E-2細(xì)胞凋亡率的變AnnexinV－PI雙染，左上象限代表損傷細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡與率用右上象限加右下象限之和表示。FCM檢測結(jié)果，對照組凋亡率為(3.90±0.34ApoG2組為(19.52±1.18)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=485.294P=0.000（1-5。1-5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋Fig.1-5ApoptosisareinducedbyAopG2inCNE-2檢測對E-2光強度為對照組(0.92±3.10)%，ApoG2組為(28.24±7.35)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意（F=31.035，P=0.003（6圖1-6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞自噬熒光強Fig.1-6AutophagiesareinducedbyAopG2inCNE-2蛋白質(zhì)印跡法檢測ApoG2對Bcl-2和Beclin1蛋白表達(dá)的影蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，ApoG2Bcl-2蛋白的表達(dá)量較對照組降低，對（0.245±0.039，ApoG2（0.056±0.055意義（F=68.909，P=0.001Beclin1（6，0（;1-7WesternblotApoG2CNE-2bcl-2、beclin1蛋白的Fig.1-7ExpressionofBcl-2proteininCNE-2cellstreatedwithAopG2detectedbyWestern鼠實驗觀察ApoG2移植瘤的抑制情接種人鼻咽癌CNE—2細(xì)胞的鼠待腫瘤大小約50mm3時，隨機分為實驗組V2/2計量腫瘤重量，拍照，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率％＝（1－T/C）×100%。T=給藥組平均瘤重，C=對照組平均瘤重。計算得腫瘤抑制率為65.49%，與對照增殖。(表1-2、圖1-8)表1- 治療結(jié)束后2組荷瘤小鼠平均瘤重及抑瘤率的比較（Table1-2Themeanweightandthemeaninhibitionrateofxenografttumorsin2治療后瘤重0ApoG2FPA：對照組B：ApoG2圖1-8鼠皮下移植瘤剝離Fig.1- PicturesoftumorbearingmodelsxenograftedwithCNE-23程序性細(xì)胞分為I型程序性細(xì)胞即細(xì)胞凋亡；II型程序性細(xì)胞死caspase近來有研究表明[11]，凋亡與自噬相互作用，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞。Bcl-2家族蛋白作為主要調(diào)控凋亡的蛋白，調(diào)控著細(xì)胞凋亡。有研究表明[7]，Bcl-2過競爭性對抗Beclin1與Bcl-2之間的結(jié)合，能夠使Beclin1出來促進(jìn)自噬[9]。Beclin1能夠與抗凋亡Bcl-2相結(jié)合，抑制MCF-7細(xì)胞的自噬能力，65.49%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤生長抑制率≥40P<0.05效果。這就為繼續(xù)研究ApoG2能有效治療鼻咽癌帶來信心。40μmol/L的實驗組，染色質(zhì)凝集和碎裂等凋亡特征非常明顯。同時流式細(xì)胞儀本實驗中，熒光顯微鏡可以觀察到ApoG2處理后，與對照組相比可見較多亮紅色的酸性自噬濾泡，同時流式細(xì)胞儀檢也測到紅色熒光強度增強，說明自噬在ApoG2對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的抑制作用也可能發(fā)揮重要的作用。蛋白質(zhì)印跡法檢測ApoG2能引起B(yǎng)cl-2達(dá)下調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)CNE-2凋亡；同時引起B(yǎng)eclin1ApoG2能有效的抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的增殖，Bcl-2的表達(dá)下降，Beclin1的表達(dá)升高，誘導(dǎo)凋亡與自噬的發(fā)生。而在ApoG2誘導(dǎo)第二部分ApoG2合放射治療誘導(dǎo)鼻CNE-2胞細(xì)胞材料與方材料與主要ApoG2由密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤中心徐梁教授惠贈，用二甲基亞心管、50ml離心管為Corning公司產(chǎn)品。（4）H-DMEMEDTA0.25%胰蛋白酶溶液、PBS科技。RIPAPMSF及BCA蛋白定量試劑盒購置于申能生物公司產(chǎn)品，預(yù)染蛋白MarkerFermentas公司產(chǎn)品，5×上樣緩沖液為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品，beta-actin購置于艾比瑪特公司產(chǎn)品，抗Bcl-2抗體購置于SantaCruzBeclin1SantaCruz二抗購置于博士德公司產(chǎn)品，PVDF膜購置于Millipore公司產(chǎn)品， 方細(xì)胞培從液氮中取出所需人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株的凍存管，迅速放置于37℃水浴入5ml含10%滅活胎牛、1×青鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)液中，輕輕吹打洗滌細(xì)胞，離心去除廢液；再向離心管中加入10ml含10%滅活胎牛、100U/mL青霉100μg/mLH-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗均取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。加入含EDTA0.25%胰蛋白酶溶液，鋪滿瓶底，置入培養(yǎng)箱中孵育消化細(xì)胞5-71000rpm5min，去廢液，再加入適量的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：4～1：5傳代。CCK-8法測定ApoG2對人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增敏作用取對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞，按照上述步驟消化細(xì)胞，待細(xì)胞計數(shù)后，以5×104個/mL，96100μL治療組（8Gy、6Gy、4Gy、2Gy，0Gy，為方便照射，96、聯(lián)合組（ApoG25、10、20、40100μL對照組（不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液424、4872hE(A+B)為藥物聯(lián)合照射的抑制率，EA，EBHoechst33258ApoG2、放射治療及聯(lián)合作用后細(xì)胞1.5×105624h50%～70%（0.1%DMSO，20μmol/L4Gy，每組加入對應(yīng)培養(yǎng)液100ul，放射治療組及聯(lián)合組照射4Gy。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。0.5mL6610minPBS20.5mLHoechst332585min，PBS23次。吖啶橙染色（Acridineorange，AO）觀察ApoG2用細(xì)胞后（0.1%DMSO，20μmol/L4Gy24h50%～70%滿度時，吸盡舊培養(yǎng)液，每100ul，4Gy48h。1mg／）驗重復(fù)3次。FCM檢測ApoG2作用細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化取適量對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞，按照上述步驟消化、重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)（0.1%DMSO，20μmol/L4Gy24h50%～70%滿度時，吸盡舊培養(yǎng)液，每100ul，4Gy48h。4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2數(shù)細(xì)胞后5×105個細(xì)胞加入流式細(xì)胞管中，離心去上清，加入400μL的BindingBuffr重懸細(xì)胞；向流式細(xì)胞管中加入5μLAnnexinV-FITC混勻后，再往流式細(xì)胞管中加入5μL碘化丙啶(propidiumiodide，PI)10min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實3FCM檢測ApoG2取適量對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞，按照上述步驟消化、重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)（0.1%DMSO， 20μmol/L4Gy，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞長滿瓶底50%～70%滿度時，吸盡舊培養(yǎng)液，每組加入對應(yīng)培養(yǎng)液100ul，放射治療組及聯(lián)合組照射4Gy。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。消化、離心、重懸后，收集細(xì)胞，加吖啶橙（濃度為1mg／L）常溫下避光染色PBS熒光通道代表綠色熒光，用FL3-Height熒光通道代表紅色熒光，F(xiàn)L3-Height熒光通道的紅色熒光增強代表細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡增多，實驗重復(fù)3次。Westernblot檢測ApoG2作用細(xì)胞后Bcl-2、Beclin1蛋白表按上述分組處理細(xì)胞，分為組（0.1%DMSO，ApoG2 （20μmol/L，（4Gy）,聯(lián)合組（ApoG220μmol/L4Gy24后，待細(xì)胞長滿瓶底50%～70%滿度時，吸盡舊培養(yǎng)液，每組加入對應(yīng)培養(yǎng)液釋的β-actin42h，1:2000ImageJ量為目的蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值之比。實驗重復(fù)3次。統(tǒng)計方采用SPSS13.0統(tǒng)計進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差S)One-WayANOVA較在方差齊性時用Bonferroni方法，方差不齊性時用DunnettT3方法。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)法檢 對E-2細(xì)胞的生長抑制作CCK-8法結(jié)果顯示，ApoG2與放射治療及其聯(lián)合作用CNE-2細(xì)胞48h，計 q值（表2-1、表2-2。由表可看出不同放射劑量間比較（F=2726.28，P=0.000，咽癌CNE-2細(xì)胞的抑制率逐漸升高。ApoG2不同藥物濃度間差異比較也具有顯（F=4316.28P=0.000（F=18.54，P=0.000果可看出，在不同放射劑量下，隨ApoG2藥物濃度的逐漸增加，抑制率也逐漸計算藥物與放射治療相互作用q>1.15，兩者協(xié)同效應(yīng)明顯。Table2-1 TheeffectofApoG2combinedwithirradiationactontheproliferationofCNE-2cellsat72h(inhibitionratio％．±s，n=4)放射 合 F P量0502468合FPTable2-2TheqvalueofApoG2combinedwithirradiationactonCNE-2cellsbyCCK-放 52468 對E-2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影Hoechst33258染色熒光染色后鏡下觀察對照組細(xì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞胞染色質(zhì)均勻，核形態(tài)規(guī)則。ApoG2碎裂等凋亡特征，且聯(lián)合作用組明顯（2-1A：對照組（0.1%DMSO）;B：ApoG2組（40μmol/L ；D：聯(lián)合圖2-1Hoechst 聯(lián)合放射線對E-2細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)的變化(×400)Figure2-1Apoptosis changesofApoG2combinedwithirradiationactonCNE-2cells（Hoechst33258staining,×400）吖啶橙（AO）熒光染色觀察對E-2細(xì)胞自噬形態(tài)學(xué)的影經(jīng)吖啶橙熒光染色后鏡下觀察對照組細(xì)胞的胞核與胞質(zhì)呈亮綠色熒光，ApoG2組、放療組及聯(lián)合作用組均可見胞質(zhì)或胞核染成亮紅色熒光，為酸性自噬泡，且聯(lián)合作用組明顯（2-2。A：對照組（0.1%DMSO）;B：ApoG2組（20μmol/L ；D：聯(lián)合圖2- Fig.2-2MorphologicalchangesofCNE-2cellstreatedwithApoG2(AO檢 對E-2細(xì)胞凋亡率的變亡率用右上象限加右下象限之和表示。FCM檢測結(jié)果，凋亡率組間均數(shù)差異具（F=149.5,P=0.000計學(xué)意義（P<0.05（2-32-3）2-3ApoG2、放射線及聯(lián)合作用于CNE-2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡Table2-3TheapotosisratioofCNE-2inducedbyApoG2,irradiation,andcombinedgroupbyFCM分 凋亡率對照 ApoG2 放療 聯(lián)合 F P A：對照組（0.1%DMSO）;B：ApoG2組（20μmol/L ；D：聯(lián)合2-3流式細(xì)胞儀檢測ApoG2、放射線及聯(lián)合作用對CNE-2胞凋亡率的影Fig.2-3DetectionofapoptosisinCNE-2cellstreatedwithApoG2,irradiation,andcombinedgroupbyFCM蛋白質(zhì)印跡法檢測ApoG2對Bcl-2和Beclin1蛋白表達(dá)的影蛋白質(zhì)印跡法檢Bcl-2Beclin1蛋白相對表達(dá)量（1111），（F=69.248,P=0.000，聯(lián)合作用組與其他三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)Bcl-2蛋白的表達(dá)量更低。Beclin1蛋白相對表達(dá)量，組間