微生物-微生物與基因工程

九、微生物與工程（2）克隆及表達(dá)宿主的策2、

工程包括哪幾個(gè)大的方向？4、工程菌種是怎樣選取的？（選擇略及理由）6、要對(duì)

微小的微生物動(dòng)“手術(shù)”需要哪些特殊的工具？這些工具是人造的還是自然就有的？8、很多微生物都只有一個(gè)細(xì)胞，而動(dòng)植物有數(shù)以億計(jì)的細(xì)胞，并且細(xì)胞各有分工，因此微生物用一個(gè)細(xì)胞完成很多細(xì)胞的功能，在

表達(dá)過程中是否會(huì)出現(xiàn)

？2014年下半年微生物學(xué)授課安排：一、緒論（4）二、純培養(yǎng)和顯微技術(shù)（3）三、微生物類群與形態(tài)（10）四、微生物的營(yíng)養(yǎng)（3）五、微生物的代謝（4）六、微生物的生長(zhǎng)繁殖及其控制（4）七、

（4）八、微生物遺傳（8）九、微生物與

工程（2）微生物的進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育與分類鑒定微生物的生態(tài)與免疫√工程（genetic

engineering）或重組DNA技術(shù)(binant

DNA

technology)對(duì)遺傳信息的分子操作和施工：對(duì)分離到的或

的

經(jīng)過改造，

載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量

產(chǎn)物，或者令生物

新的性狀。（P264第一段）二十世紀(jì)生物科學(xué)具有劃時(shí)代意義的巨大事件，推動(dòng)了生物科學(xué)的迅猛發(fā)展，并帶動(dòng)了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起。（參見P264）微生物在

工程的興起和發(fā)展過程中起著不可替代的作用?。▍⒁奝267）“微生物與工程”第一節(jié)微生物與克隆載體第二節(jié)

工程的常用技術(shù)和方法第9章微生物與

工程克隆載體的特點(diǎn)與應(yīng)用PCR技術(shù)的原理與方法其他需要自己看書掌握的內(nèi)容見本思考的題目√（1）獨(dú)立的子－能夠進(jìn)行獨(dú)立自主的（5）載體DNA須易于分離和實(shí)驗(yàn)操作克隆載體的特點(diǎn)與應(yīng)用克隆載體（cloning

vector）作為克隆載體的基本要求（P274第一段）：（參見p274）√（2）具有若干限制酶的單一切割位點(diǎn)，便于外源DNA的√（3）具有可供選擇的遺傳標(biāo)記－便于對(duì)陽性克隆的篩選和鑒定（4）具有一定的安全性－胞內(nèi)不重組和轉(zhuǎn)移；胞外不擴(kuò)散質(zhì)粒載體√λ噬菌體載體√質(zhì)粒載體M13噬菌體載體噬菌粒載體真核細(xì)胞的克隆載體人工a）低分子量有利于DNA的分離和操作；特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)入細(xì)胞；d）具有安全性；質(zhì)粒載體克隆外源DN段的大小一般不超過15Kb（參見P274

~

275）參見p274

圖10-6參見p274

圖10-6EcoO

109

2674Sspl2501AatII

26,1"7

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IPpa11766400

4204'40

460AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCA

TEcoRI

SacI

K

p

n

I B

a

m

H

IXbalSmaIXmalHincUAce

ISaflPstl

SphI

HindI111lacZ'一飛rlleMetThr(Met)?J

All

treated

bacteria

are

spread

on

a

nutrientagar

plate

containing

ampicillin

and-galactosidase

substrate,

and

incubated8

White

colonies

that

appear

must

containforeign

DNA.

Blue

colonies

must

notcontain

foreign

DNAv/3-galactosidase

gene

(/acZ)cillin-(amp芍RestrictionSItePolylinkerForeign

ONARestrictionsites恁binantplasmidBacteriumF

ig

u

r

e

9

.

9

O

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h

o

d

of

selectingbinant

bacteria.W

hy

are

some

c

olon

沁b

lu

e

andotherswhite?具有細(xì)菌啟動(dòng)子功能的嗜鹽古菌DN段的克隆嗜鹽古菌總DNA隨機(jī)酶降解片段質(zhì)粒載體(pKK232-8)篩選氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子穿梭載體（Shuttle

vector）起始區(qū)自我

能力pBE2：大腸桿菌－枯草胞桿菌穿梭載體將野生型λ噬菌體DNA進(jìn)行改造后建成，主要是去掉噬菌體DNA上過多的常用限制酶的酶切位點(diǎn)，及對(duì)非必要

區(qū)域進(jìn)行改造。（P275第2大段）特點(diǎn)：1）分子遺傳學(xué)背景清楚；2）容量較大（能容納大約23kb的外源DN

段）；3）

效率高。其

宿主細(xì)胞的效率幾乎可達(dá)100％，

而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只有0.1％。4）具有更為狹窄的寄主范圍，更加安全。（參見P275）粘性末端5'-

pGGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA5'-

p(a)l環(huán)化作用COS多、．－－－....

/，Z＇，沁少開環(huán)結(jié)構(gòu)(b)與溶原性相關(guān)的

可以被外源DNA取代而不影響λ噬菌體的、

和裂解宿主細(xì)胞的能力。型載體（insert

vector）取代型載體（replacement

vector）生重組噬菌體DNA也可不經(jīng)過體外包裝而直接通過轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)化）方式進(jìn)入宿主細(xì)胞；生

經(jīng)過體外

操作和包裝后形成重組噬菌體，可以通過正常的途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞；質(zhì)粒和噬菌體載體都可用于構(gòu)建

文庫；但后者更有優(yōu)勢(shì)：容納的外源DN

段較大；以途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率比轉(zhuǎn)化高；以探針雜交－技－術(shù)－對(duì)－重－組－噬有菌關(guān)體技進(jìn)術(shù)行在篩第選10章介紹1．原理特點(diǎn)：在體外模擬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的DNA過程（參見P270）PCR技術(shù)的原理與方法parenmolecule3

}HelicaseFree

3'-0Hgle-stranded

binding

proteinDNA

polymeraseFigure

6.17

Events

at

the

DNA

replic

at

i

o

n

f

ork.LaggingstrandSemiconservative『eplicationnewstranddaughter

moleculedaughter

moleculeThe

Nobel

Prize

in

Chemistry

1993"for

contributions

to

the

developments

of

methodswithin

DNA-based

chemistry""for

his

invention

of

the

polymerase

chain

reaction

(PCR)

method"Kary

B.

MullisLa

Jolla,

CA,

USAB:1944*One

Friday

night

I

was

driving,…….

My

girlfriend,Jennifer

Barnett,

was

asleep.I

was

thinking.

…….*However,

shocking

to

me,

not

one

of

my

friends

or

colleagues

would

get

excitedover

the

potential

for

such

a

process.*In

September

I

did

my experiment.

I

like

to

try

the

easiest

possibilities

.So

one

night

I

puthuman

DNAand

the

nerve

growth

factor

primers

in

alittlescrew-cap

tube

with

an

O-ring

and

a

purple

top.I

boiled

for

a

few

minutes,

cooled,added

about

10

units

of

DNA

polymerase,

closed

the

tube

and

left

it

at

37°.

Itwasexactly

midnight

on

the

ninth

of

September.*The successful

experiment

happened

on

December

16th.

I

remember

thedate.

It

was

the

birthday

of

Cynthia,

my

former

wife

from

Kansas

City,

who

hadencouraged

me

to

write

fiction

and

bore

us

two

fine

sons.

I

had

strayed

fromCynthia

eventually

tospend

two

tumultuous

years

with

Jennifer.Kary

B.

Mullis基本原理：模板

引物

DNA聚合酶4種dNTP（參見P270～271）1.2Single

strands1.1Eu

0

9

0

eouEq

Jos

qe

a>l-e

-e

a1.00.90.8Melting—Doublestrand6?·2＿9TmII

I

I

I

l＼80

85

90

95

100ocHelicaseFree

3'-0H今Slow

coolingC

A

C

T

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T＇，3

5LaggingstrandSingle-stranded

binding

proteinDNA

polymeraseDouble

stranreformedFigure

6.1vnt

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t

h

DNA

re

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.Heated