生化實驗三-果蔬中蛋白質(zhì)含量測定課件

生物化學(xué)實驗第一部分果蔬成分的生化分析綜合實驗一：果蔬成分的生化分析實驗一果蔬中維生素C的定量測定（4學(xué)時）實驗二果蔬中總糖及還原糖含量的測定（4學(xué)時）實驗三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測定（4學(xué)時）實驗四果蔬中過氧化物酶分析（12學(xué)時）實驗材料：冬棗＋柚子——1～4組梨（2個品種）——5～8組盤菜＋蘿卜——9～12組一、目的

1、掌握蛋白質(zhì)測定的方法和技術(shù)。2、了解果蔬中蛋白質(zhì)的含量。二、原理考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。三、實驗器材1、可見光分光光度計2、旋渦混合器3、試管16支四、實驗試劑1、標準蛋白質(zhì)溶液——牛血清清蛋白(bsa)：配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。2、考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀釋至1L。3、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）4、各種果蔬加入考馬斯亮藍G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色測定，記錄A595。以各管相應(yīng)標準蛋白質(zhì)含量（g）為橫坐標、A595為縱坐標，繪制標準曲線。3、樣品測定：試管中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL，再加入5.0mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長下比色，記錄A595。根據(jù)所測A595從標準曲線上查得蛋白質(zhì)含量。實驗三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測定（Folin-酚試劑法

）一、目的

1、掌握蛋白質(zhì)測定的方法和技術(shù)。2、了解果蔬中蛋白質(zhì)的含量。二、原理

Folin-酚試劑法是雙縮脲法的發(fā)展。其試劑由甲、乙兩部分組成。甲試劑相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與肽鍵起呈色反應(yīng)。乙試劑（即Folin-酚試劑）在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍色（鉬藍和鎢蘭的混合物），其顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此通過比色可測定蛋白質(zhì)的濃度。本方法最大的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍，較紫外分光光度法靈敏10～20倍。三、實驗器材1、分光光度計2、電熱恒溫水浴箱3、試管15×150mm4、刻度吸管0.5mL、1mL、5mL5、試管架6、容量瓶500mL7、坐標紙四、實驗試劑1、甲試劑：①：2g無水碳酸鈉，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液100mL混勻；②：稱取CuSO4·5H2O0.5g，加入1%（35mmol/L）酒石酸鉀鈉溶液100mL，混勻。使用前將①與②按50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。（混合后，試劑只能使用一天，但堿性溶液和0.5%CuSO4·5H2O溶液可分別長期保存）3、牛血清白蛋白標準液（200g/mL）：準確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液潤濕溶解，加蒸餾水到250mL。4、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）5、各種果蔬五、操作1、標準曲線繪制：取7支試管，按下表加入各試劑。試劑0123456牛血清白蛋白標準液0.0mL0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL蒸餾水1.0mL0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲試劑5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL2、樣品制備：稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500rpm離心15～20min，其上清液即為蛋白質(zhì)提取液，供分析用。（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL）3、樣品測定：取2只試管編號，按下表加入試劑：試劑空白管測定管蛋白質(zhì)提取液-1.0mL蒸餾水1.0mL-甲試劑5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL注意事項：1、Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，在加入到堿性的銅離子-蛋白質(zhì)溶液中時（pH約10），必須立即混勻，以便在磷鉬酸、磷鎢酸試劑破壞之前，即發(fā)生還原反應(yīng)。2、本法受多種因素干擾，凡對雙縮脲反應(yīng)起干擾作用的基團以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾Folin-酚反應(yīng)。3、所測蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸也會干擾Folin-酚反應(yīng)。在測試時應(yīng)排除干擾因素或作空白試驗。濃度較低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等（各0.5%左右）、硫酸鈉