選修三11DNA重組技術(shù)的基本工具課件

你想過嗎?你想過嗎?定向基因改造設(shè)想

設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。定向基因改造設(shè)想設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿望，在DNA分子水平上進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。什么是基因工程?基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿一、基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程實質(zhì)(原理)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組優(yōu)點：⑴定向改造生物性狀⑵克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙⑶育種周期短一、基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本1、DNA是遺傳物質(zhì)。2、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)3、中心法則的提出4、遺傳密碼的破譯二、基因工程的誕生（一）理論基礎(chǔ)：1、DNA是遺傳物質(zhì)。二、基因工程的誕生（一）理論基礎(chǔ)：1)基因轉(zhuǎn)移載體——質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)2)多種限制酶、連接酶，以及逆轉(zhuǎn)錄酶（工具酶）的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實驗的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明（二）技術(shù)發(fā)明：1)基因轉(zhuǎn)移載體——質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)（二）技術(shù)發(fā)明：三、基因工程的原理1、不同生物DNA分子得以重新拼接的基礎(chǔ)（1）DNA分子的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。（2）DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。（3）所有DNA堿基互補(bǔ)配對方式相同。2、外源DNA在受體內(nèi)表達(dá)的基礎(chǔ)（1）基因是控制生物性狀的基本單位，具有相對獨立性。（2）遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。（3）生物界共用一套遺傳密碼。三、基因工程的原理1、不同生物DNA分子得以重新拼接的基礎(chǔ)2基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點是什解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來抗蟲基因與棉花DNA“縫合”抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子手術(shù)刀”——

限制性核酸內(nèi)切酶“分子縫合針”——

DNA連接酶“分子運輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體關(guān)鍵步驟二：關(guān)鍵步驟三：解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從DNA重組技術(shù)的基本工具㈠限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”①來源：主要從原核生物中分離純化出來。②種類：已從近300種微生物中分離出4000種限制酶。③作用：1.能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。④作用特點：具有特異性（專一性）。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子，⑤限制酶的識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成作用結(jié)果形成兩種末端：黏性末端或平末端DNA重組技術(shù)的基本工具㈠限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5-磷酸二酯鍵3’端5’端3’端5’端一個核苷酸核糖上第3位的羥基與下一個核苷酸核糖上第5位的磷酸羥基脫水縮合成酯鍵，該酯鍵稱又3,5磷酸二酯鍵。磷酸二酯鍵：磷酸二酯鍵：即脫氧核糖、磷酸之間的連接G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5仔細(xì)觀察各限制酶識別的特定序列有何特點？限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向重復(fù)的。仔細(xì)觀察各限制酶識別的特定序列有何特點？限制酶的識別序列限制

黏性末端

黏性末端EcoRI限制酶的切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。中軸線黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割CTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG練習(xí)使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

目的基因CTTCATGSmaⅠ平末端平末端只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線SmaⅠ平末端平末端只能識別CCCGGG序列，并在C和平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識別序列的中⑥限制酶的作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。⑥限制酶的作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？P4原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？P4原核生物易課后習(xí)題：為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?主要切割外源DNA，而對自身的DNA不起作用，達(dá)到保護(hù)自身的目的。原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。課后習(xí)題：為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?主要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶要切兩個切口，產(chǎn)生四1.下列關(guān)于限制酶的說法正確的是A．限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中很少B．一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列C．不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端D．限制酶的作用部位是特定的核苷酸形成的氫鍵B2.在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的DNA片斷時，需使用A．同種限制酶B．兩種限制酶C．同種DNA連接酶D．兩種DNA連接酶

A3.下列四條DNA片段，可能是由同一種限制酶切割而成的是A．①②

B．②③C．③④ D．②④D1.下列關(guān)于限制酶的說法正確的是A．限制酶廣泛存在于各種生物DNA連接酶連接酶的作用：將互補(bǔ)配對的兩個黏性末端或平末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子?；蜻M(jìn)行了切割以后就有了切口，怎樣才能將有切口的基因與其他基因縫合在一起呢？積極思考DNA連接酶連接酶的作用：將互補(bǔ)配對的兩個黏性末端或平末端連（二）DNA連接酶分子縫合針磷酸二酯鍵G

AATTCCTTAA

G

GP

AP把兩條雙鏈DNA片段之間的縫隙“縫合”起來。即將脫氧核糖和磷酸連接起來.要實現(xiàn)目的基因與載體的連接則在對其切割時應(yīng)選用

限制酶。1、作用：作用原理催化磷酸二酯鍵形成

2、作用部位：3、分類E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶根據(jù)酶的來源不同，可以將這些酶分為兩類：同一種（二）DNA連接酶分子縫合針磷酸二酯鍵G

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。類型來源功能相同點差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起作用應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA連接酶與限制酶的比較(1)區(qū)別：(2)兩者的關(guān)系可表示為：使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂用于提取目的基因和切割載體在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵用于目的基因和載體的連接作用應(yīng)用限制性核DNADNA連接酶與限制酶的比較(2)兩者的兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合

E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵由于氫鍵是分子間作用力，其斷裂與重新形成均以限制酶和DNA連接酶無關(guān)。E·coliDNA連接酶或T4DNA連DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用AATTGCAATTAATDNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點模板作用對象

作用結(jié)果用途都能催化兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)，但組成和性質(zhì)不同

不需要需要形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵(用于基因工程操作)將單個核苷酸加到已存在的DNA片段的3′端的羥基上，形成磷酸二酯鍵(用于DNA的復(fù)制)將存在的DNA片段連接成完整重組DNA分子DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)模板作用結(jié)限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有一個酶Ⅱ的切點。（1）請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

（2）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？

可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互補(bǔ)的）限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)（三）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體分子運輸車

具備哪些條件才能充當(dāng)“分子運輸車”？A、具有多個限制酶切割位點，以便外源基因插入其中；B、具有特殊的標(biāo)記基因，便于鑒定和選擇。C、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；D、對受體細(xì)胞無害2、載體的作用1、載體必須具備的條件：3、種類：將外源基因送入受體細(xì)胞。質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒等E、載體DNA分子大小應(yīng)適合,以便提取和在體外進(jìn)行操作,太大就不便操作.在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制（三）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體分子運輸車具備哪些條有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)粒——裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運載體——質(zhì)粒

實際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，并不具備所有條件，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點能復(fù)制小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個或多個限制酶切位點具標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞無害質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物

、動植物病毒小結(jié)基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯鍵

項目種類作用底物作用部位作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶DNA解旋酶幾種酶的比較：DNA分子磷酸二酯鍵形成黏性末端或平末端DNA分子片段磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵DNA分子DNA分子脫氧核苷酸形成重組DNA分子形成子代DNA分子形成脫氧核苷酸形成單鏈DNA分子堿基對間的氫鍵(1)不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一個DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。(2)不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互補(bǔ)則可以相互重新配對。 項目作用底物作用部位作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DN四種酶的作用部位圖解(1)作用于a(磷酸二酯鍵)的酶有：(2)作用于b(氫鍵)的酶是:

限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶。解旋酶。(1)DNA連接酶的作用不是連接互補(bǔ)的堿基之間的氫鍵，而是脫氧核糖和磷酸間的磷酸二酯鍵。(2)限制酶切割一次，會產(chǎn)生2個黏性末端或平末端，水解2個磷酸二酯鍵。(3)限制酶的作用并非只是切取目的基因，還用于切割載體。四種酶的作用部位圖解限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶。解旋1.下列關(guān)于DNA連接酶的敘述中，正確的是①催化相同黏性末端的DNA片段之間的連接②催化不同黏性末端的DNA片段之間的連接③催化兩個黏性末端互補(bǔ)堿基間氫鍵的形成④催化DNA分子兩條鏈的脫氧核糖與磷酸之間的磷酸二酯鍵的形成A．①③B．②④C．②③D．①④D2.下列哪項不是基因工程中經(jīng)常使用的“分子運輸車”A．細(xì)菌質(zhì)粒B．λ噬菌體的衍生物C．動植物病毒D．細(xì)菌核區(qū)的DNAD3.下列關(guān)于基因工程中所選用的質(zhì)粒的說法，錯誤的是A．不能沒有標(biāo)記基因B．是小型鏈狀的DNA分子C．能夠自我復(fù)制D．可與目的基因重組B1.下列關(guān)于DNA連接酶的敘述中，正確的是①催化相同黏性4.下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是(

)

A．①②③④ B．①②④③

C．①④②③ D．①④③②本題考查不同工具酶的作用及作用特點。圖示中①表示該酶切割DNA分子雙鏈產(chǎn)生黏性末端的過程，用到的酶是限制性核酸內(nèi)切酶；②是黏性末端連接的過程，用到的酶是DNA連接酶；③是DNA分子解旋的過程，要用解旋酶；④是DNA復(fù)制過程，需要DNA聚合酶。C4.下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表5.下面是四種不同質(zhì)粒的示意圖，其中ori為復(fù)制必需的序列，amp為氨芐青霉素抗性基因，tet為四環(huán)素抗性基因，箭頭表示一種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點。若要得到一個能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的含重組DNA的細(xì)胞，應(yīng)選用的質(zhì)粒是(

)A項破壞了復(fù)制必需的序列，不能復(fù)制。B項氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因都完好，在四環(huán)素培養(yǎng)基上和氨芐青霉素培養(yǎng)基上都能生長。C項氨芐青霉素抗性基因被破壞，四環(huán)素抗性基因完好，能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長。D項氨芐青霉素抗性基因完好，四環(huán)素抗性基因被破壞。C5.下面是四種不同質(zhì)粒的示意圖，其中ori為復(fù)制必需的序列，你想過嗎?你想過嗎?定向基因改造設(shè)想

設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。定向基因改造設(shè)想設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿望，在DNA分子水平上進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。什么是基因工程?基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿一、基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程實質(zhì)(原理)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組優(yōu)點：⑴定向改造生物性狀⑵克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙⑶育種周期短一、基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本1、DNA是遺傳物質(zhì)。2、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)3、中心法則的提出4、遺傳密碼的破譯二、基因工程的誕生（一）理論基礎(chǔ)：1、DNA是遺傳物質(zhì)。二、基因工程的誕生（一）理論基礎(chǔ)：1)基因轉(zhuǎn)移載體——質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)2)多種限制酶、連接酶，以及逆轉(zhuǎn)錄酶（工具酶）的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實驗的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明（二）技術(shù)發(fā)明：1)基因轉(zhuǎn)移載體——質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)（二）技術(shù)發(fā)明：三、基因工程的原理1、不同生物DNA分子得以重新拼接的基礎(chǔ)（1）DNA分子的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。（2）DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。（3）所有DNA堿基互補(bǔ)配對方式相同。2、外源DNA在受體內(nèi)表達(dá)的基礎(chǔ)（1）基因是控制生物性狀的基本單位，具有相對獨立性。（2）遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。（3）生物界共用一套遺傳密碼。三、基因工程的原理1、不同生物DNA分子得以重新拼接的基礎(chǔ)2基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點是什解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來抗蟲基因與棉花DNA“縫合”抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子手術(shù)刀”——

限制性核酸內(nèi)切酶“分子縫合針”——

DNA連接酶“分子運輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體關(guān)鍵步驟二：關(guān)鍵步驟三：解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從DNA重組技術(shù)的基本工具㈠限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”①來源：主要從原核生物中分離純化出來。②種類：已從近300種微生物中分離出4000種限制酶。③作用：1.能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。④作用特點：具有特異性（專一性）。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子，⑤限制酶的識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成作用結(jié)果形成兩種末端：黏性末端或平末端DNA重組技術(shù)的基本工具㈠限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5-磷酸二酯鍵3’端5’端3’端5’端一個核苷酸核糖上第3位的羥基與下一個核苷酸核糖上第5位的磷酸羥基脫水縮合成酯鍵，該酯鍵稱又3,5磷酸二酯鍵。磷酸二酯鍵：磷酸二酯鍵：即脫氧核糖、磷酸之間的連接G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5仔細(xì)觀察各限制酶識別的特定序列有何特點？限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向重復(fù)的。仔細(xì)觀察各限制酶識別的特定序列有何特點？限制酶的識別序列限制

黏性末端

黏性末端EcoRI限制酶的切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。中軸線黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割CTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG練習(xí)使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAA

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目的基因CTTCATGSmaⅠ平末端平末端只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線SmaⅠ平末端平末端只能識別CCCGGG序列，并在C和平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識別序列的中⑥限制酶的作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。⑥限制酶的作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？P4原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？P4原核生物易課后習(xí)題：為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?主要切割外源DNA，而對自身的DNA不起作用，達(dá)到保護(hù)自身的目的。原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。課后習(xí)題：為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?主要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶要切兩個切口，產(chǎn)生四1.下列關(guān)于限制酶的說法正確的是A．限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中很少B．一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列C．不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端D．限制酶的作用部位是特定的核苷酸形成的氫鍵B2.在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的DNA片斷時，需使用A．同種限制酶B．兩種限制酶C．同種DNA連接酶D．兩種DNA連接酶

A3.下列四條DNA片段，可能是由同一種限制酶切割而成的是A．①②

B．②③C．③④ D．②④D1.下列關(guān)于限制酶的說法正確的是A．限制酶廣泛存在于各種生物DNA連接酶連接酶的作用：將互補(bǔ)配對的兩個黏性末端或平末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子?；蜻M(jìn)行了切割以后就有了切口，怎樣才能將有切口的基因與其他基因縫合在一起呢？積極思考DNA連接酶連接酶的作用：將互補(bǔ)配對的兩個黏性末端或平末端連（二）DNA連接酶分子縫合針磷酸二酯鍵G

AATTCCTTAA

G

GP

AP把兩條雙鏈DNA片段之間的縫隙“縫合”起來。即將脫氧核糖和磷酸連接起來.要實現(xiàn)目的基因與載體的連接則在對其切割時應(yīng)選用

限制酶。1、作用：作用原理催化磷酸二酯鍵形成

2、作用部位：3、分類E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶根據(jù)酶的來源不同，可以將這些酶分為兩類：同一種（二）DNA連接酶分子縫合針磷酸二酯鍵G

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。類型來源功能相同點差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起作用應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA連接酶與限制酶的比較(1)區(qū)別：(2)兩者的關(guān)系可表示為：使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂用于提取目的基因和切割載體在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵用于目的基因和載體的連接作用應(yīng)用限制性核DNADNA連接酶與限制酶的比較(2)兩者的兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合

E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵由于氫鍵是分子間作用力，其斷裂與重新形成均以限制酶和DNA連接酶無關(guān)。E·coliDNA連接酶或T4DNA連DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用AATTGCAATTAATDNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點模板作用對象

作用結(jié)果用途都能催化兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)，但組成和性質(zhì)不同

不需要需要形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵(用于基因工程操作)將單個核苷酸加到已存在的DNA片段的3′端的羥基上，形成磷酸二酯鍵(用于DNA的復(fù)制)將存在的DNA片段連接成完整重組DNA分子DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)模板作用結(jié)限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有一個酶Ⅱ的切點。（1）請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

（2）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？

可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互補(bǔ)的）限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)（三）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體分子運輸車

具備哪些條件才能充當(dāng)“分子運輸車”？A、具有多個限制酶切割位點，以便外源基因插入其中；B、具有特殊的標(biāo)記基因，便于鑒定和選擇。C、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；D、對受體細(xì)胞無害2、載體的作用1、載體必須具備的條件：3、種類：將外源基因送入受體細(xì)胞。質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒等E、載體DNA分子大小應(yīng)適合,以便提取和在體外進(jìn)行操作,太大就不便操作.在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制（三）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體分子運輸車具備哪些條有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)粒——裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運載體——質(zhì)粒

實際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，并不具備所有條件，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點能復(fù)制小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個或多個限制酶切位點具標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞無害質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物

、動植物病毒小結(jié)基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯鍵

項目種類作用底物作用部位作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)