知柏地黃丸對瘦素誘導(dǎo)特發(fā)性性早熟模型小鼠的影響

知柏地黃丸對瘦素誘導(dǎo)特發(fā)性性早熟模型小鼠的影響【關(guān)鍵詞】知柏地黃丸/藥理學(xué)；性早熟/中藥療法；黃體生成素/血液；雌二醇/血液；疾病模型，動物；小鼠性早熟是一種生長發(fā)育異常，表現(xiàn)為青春期特征提早出現(xiàn)。性早熟以女童為多見，其中特發(fā)性中樞性性早熟〔IPP〕占女孩性早熟的80%～90%，男童性早熟的40%，IPP的發(fā)病機理尚未完全清楚，可能系下丘腦—垂體—性腺軸〔HPGA〕功能的提早發(fā)動所致。由于其確切原因未明，因此無法復(fù)制出理想的IPP動物模型。一般認為青春期的發(fā)動需要一定體質(zhì)量和體脂的積累，瘦素〔Leptin〕可能涉及獲得臨界體脂總量的神經(jīng)內(nèi)分泌通道的信號作用，這可能是青春期啟動的一個允許因子［1］。本實驗擬采用Leptin刺激未成熟雌性BALB/小鼠誘導(dǎo)IPP動物模型，觀察知柏地黃丸對抗IPP的作用，現(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1動物選用18日齡BALB/雌性小鼠61只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實驗動物中心提供〔合格證號：中科動管會第001號〕，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自然照明，隨意取食和飲水。1.4觀察指標及方法1.4.1陰道開口據(jù)預(yù)試驗觀察正常BALB/雌性小鼠陰道開口時間一般在日齡26～28d，以27d較為集中。本實驗于造模后第3天〔即22日齡〕開場每天下午4點觀察各組陰道開口，26日齡時完畢。1.4.2體質(zhì)量變化每天記錄各組小鼠體質(zhì)量變化，實驗完畢時，取前后體質(zhì)量進展比擬。1.4.3血清黃體生成素〔LH〕、雌二醇〔E2〕含量測定實驗完畢時，各組動物稱體質(zhì)量后，摘取眼球眼眶取血，3500r/in、4℃離心15in，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法分別測定LH、E2含量。1.4.4子宮、卵巢質(zhì)量各組動物眼眶取血后，摘取子宮、卵巢分別稱質(zhì)量，計算臟器指數(shù)〔〕：=臟器/bdy。1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進展數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用列聯(lián)表的rsstabs過程進展統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用獨立樣本t檢驗、及非參數(shù)統(tǒng)計的兩獨立樣本秩和檢驗。2結(jié)果2.1各組小鼠陰道開口情況比擬各組小鼠開場出現(xiàn)陰道開口的天數(shù)及小鼠數(shù)見表1，正常對照組于造模第5天才有2/9小鼠出現(xiàn)陰道開口，陰道開口的平均天數(shù)是6.3d。IPP模型組于造模第3天即有2/10小鼠出現(xiàn)陰道開口，陰道開口的平均天數(shù)是4.6d，比正常對照組提早1.7d〔P＜0.05〕。從造模第4天開場，IPP模型組與正常對照組的陰道開口小鼠數(shù)比擬出現(xiàn)差異，造模第4、5、7天，IPP模型組小鼠的陰道開口較正常對照組提早〔P＜0.05〕，提示Leptin可促進未成熟雌性小鼠陰道開口提早。知柏地黃丸高劑量組于造模第5天才有2/11小鼠出現(xiàn)陰道開口，與模型組比擬，于造模第4～6天對Leptin所致陰道開口提早均有抑制作用，尤以造模第5、6天抑制作用明顯〔P＜0.05或P＜0.01〕；知柏地黃丸低劑量組及甲地孕酮對照組于造模第4天均有2/10小鼠出現(xiàn)陰道開口，與正常對照組比擬，造模后不同時間點知柏地黃丸低劑量組及甲地孕酮對照組與正常對照組比擬，陰道開口數(shù)之間差異均無顯著性意義〔P＞0.05〕，提示低劑量知柏地黃丸及作為臨床使用的陽性對照藥甲地孕酮，在本實驗中對抗Leptin誘導(dǎo)的開口提早的作用不明顯。表1各組小鼠陰道開口數(shù)比擬統(tǒng)計方法：用列聯(lián)表分析的rsstabs過程進展計算；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，與正常對照組比擬；③Ｐ＜０.０５，④Ｐ＜０.０１，與IPP模型組比擬2.2各組子宮、卵巢質(zhì)量及體質(zhì)量比擬表2結(jié)果顯示，與正常對照組相比，IPP模型組小鼠的子宮、卵巢質(zhì)量有增加趨勢，但兩組差異無顯著性意義〔P＞0.05〕；知柏地黃丸高劑量的子宮、卵巢質(zhì)量較IPP模型組均有降低趨勢，但兩組之間差異均無顯著性意義〔P＞0.05〕。知柏地黃丸低劑量組子宮質(zhì)量較IPP模型組降低〔P＜0.05〕，卵巢質(zhì)量與IPP模型比擬差異無顯著性意義〔P＞0.05〕；陽性對照藥甲地孕酮能抑制Leptin所致子宮質(zhì)表2各組子宮、卵巢質(zhì)量及體質(zhì)量比擬統(tǒng)計方法：獨立樣本t檢驗；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，與正常對照組比擬；③Ｐ＜０.００5，④Ｐ＜０.００１，與IPP模型組比擬2.3各組子宮、卵巢指數(shù)比擬為排除子宮、卵巢質(zhì)量增加是由于體質(zhì)量變化影響所致，比擬各組子宮、卵巢指數(shù)〔分別以子宮或卵巢質(zhì)量除以體質(zhì)量〕的變化。表3結(jié)果顯示，與正常對照組比擬，IPP模型組小鼠的子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)均有升高趨勢，尤以子宮指數(shù)升高明顯，但兩組差異無顯著性意義〔P＞0.05〕。提示Leptin雖具有一定的促進性腺生長，升高子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)的作用，但作用不明顯。與IPP模型組比擬，低劑量知柏地黃丸能抑制Leptin致子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)升高〔P＜0.05或P＜0.01〕；高劑量知柏地黃丸亦能使子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)下降，但兩組之間差異無顯著性意義〔P＞0.05〕。甲地孕酮能抑制Leptin所致子宮指數(shù)的升高〔P＜0.05〕，但對卵巢指數(shù)無顯著影響〔P＞0.05〕。3討論陰虛火旺是IPP的主要病機，因此滋陰降火表4各組血清LH、E2程度比擬統(tǒng)計方法：獨立樣本t檢驗；①Ｐ＜０.０1，與正常對照組比擬；②Ｐ＜０.０5，③Ｐ＜０.０1，與IPP模型組比擬是IPP的主要治療法那么［3］。知柏地黃丸是滋陰降火的傳統(tǒng)名方，治療特發(fā)性性早熟〔真性性早熟〕和假性性早熟均獲得一定療效［4］。IPP主要是因于HPGA功能的提早發(fā)動。青春期是一個性成熟的過程，而青春發(fā)育啟動主要是促性腺激素釋放激素〔GnRH〕脈沖釋放頻率和峰度增加所觸發(fā)，尤其是夜間GnRH脈沖式分泌的增加，被認為是青春期開場啟動的標志［5］。但GnRH脈沖釋放頻率和峰度增加確實切機制仍然未明。有學(xué)者認為，只有根本體脂到達最低閾值才能維持正常的月經(jīng)周期和觸發(fā)青春期，此即臨界體脂學(xué)說。其中Leptin在感知機體的營養(yǎng)狀態(tài)及個體大小和體脂含量，從而啟動GnRH的高頻率釋放中起關(guān)鍵作用［6］。在人類性成熟和未成熟個體內(nèi)，Leptin的循環(huán)程度有顯著性差異，且Leptin先于青春期前生殖激素尚未升高之時升高［7］，因此，Leptin可能是人類青春發(fā)育啟動的允許因子〔但并不是唯一的青春啟動刺激因子〕。當Leptin作為一種外源性刺激作用于初情期前的動物，可能使HPGA功能提早發(fā)動，從而模擬人類IPP主要病理生理變化。本實驗采用Leptin誘導(dǎo)剛離乳的BALB/雌性幼鼠復(fù)制IPP動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Leptin可致模型小鼠陰道開口提早，LH程度升高，E2程度、子宮質(zhì)量和子宮指數(shù)、卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)有增加的趨勢，提示Leptin有一定的促進子宮、卵巢生長發(fā)育的作用，與Farid等的研究結(jié)果一致［2］。以上結(jié)果說明Leptin在誘導(dǎo)性早熟的過程中發(fā)揮了啟動因子的作用，其可能通過使LH分泌增加提早啟動垂體—性腺軸的功能，從而誘導(dǎo)性成熟的提早。第二性征的提早發(fā)育是IPP的臨床特征。雌鼠〔嚙齒類動物〕最能代表第二性征發(fā)育的指征即是陰道開口，本實驗發(fā)現(xiàn)知柏地黃丸高劑量組從造模第3天起即對Leptin促進幼齡雌鼠陰道開口提早具有抑制作用。性腺軸功能的啟動，可促進其靶腺—子宮和卵巢的生長發(fā)育。知柏地黃丸低劑量組對Leptin誘導(dǎo)的子宮質(zhì)量、子宮指數(shù)及卵巢指數(shù)升高有顯著抑制作用。觀察各組小鼠體質(zhì)量的變化，可以反映性成熟的啟動與體質(zhì)量和體內(nèi)能量代謝的關(guān)系。本實驗中發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠體質(zhì)量略為減輕，與正常對照組比擬差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Leptin調(diào)控生殖功能的生理作用并非繼發(fā)于其對體質(zhì)量和能量平衡的調(diào)節(jié)。這是與臨界體脂學(xué)說不一致之處，但與Ahia的研究結(jié)果一致［8］。知柏地黃丸高、低劑量均無對抗Leptin減輕體質(zhì)量的作用。LH是初情期的標志，LH優(yōu)勢性升高為IPP的臨床標志之一［9］。LH在正常月經(jīng)周期中呈周期性變化，在排卵前到達峰值，因此亦作為預(yù)測排卵常用的最顯著的激素標準。本實驗發(fā)現(xiàn)Leptin能誘導(dǎo)IPP模型小鼠LH、E2程度升高，這與hehab等的實驗結(jié)果不一致，hehab等于雌鼠出現(xiàn)動情期的29日齡時，采血測定LH、E2程度，結(jié)果顯示均低于磷酸鹽緩沖液〔PBS〕組，該學(xué)者認為是與實驗組動情期較早出現(xiàn)是一致的［2］。本實驗IPP模型小鼠LH、E2升高，可能因于26日齡的動物處于不同的動情周期如排卵前期所致；同時發(fā)現(xiàn)高、低劑量的知柏地黃丸有對抗Leptin誘導(dǎo)LH升高的作用，但對E2程度無顯著影響。綜合所述，以Leptin腹腔注射于幼齡BALB/雌鼠，可提早啟動垂體—性腺軸功能，給促性腺激素分泌以答應(yīng)信號，誘導(dǎo)IPP的出現(xiàn)。知柏地黃丸可能是通過抑制Leptin誘導(dǎo)垂體—性腺軸功能的提早啟動，抑制垂體分泌LH進而抑制E2的分泌，或直接抑制Leptin對性腺的作用，從而降低Leptin誘導(dǎo)的子宮質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)升高，抑制Leptin誘導(dǎo)的幼齡雌鼠陰道開口的提早，發(fā)揮其對抗Leptin誘導(dǎo)性早熟的作用【參考文獻】［1］ZhangY,PrenaR,affEi,etal.Psitinallningftheusebesegeneanditshuanhlgue［J］.Nature,1994,372:425.［2］FaridFhehab,Khalidunzih,RnghuaLu,etal.Earlynsetfreprdutivefuntininnralfealeietreatedithleptin［J］.Siene,1997,275(3):88.［3］時毓民，俞建.性早熟女童陰虛火旺本質(zhì)的討論［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，7：30.［4］楊美琳，劉妍，申巧玲.知柏地黃丸治療兒童性早熟25例結(jié)果分析［J］.河南中醫(yī)1999，5：59.［5］陳非.瘦素與男性青春期發(fā)育［J］.國外醫(yī)學(xué)：婦幼保健分冊，2002，13〔4〕：177.［6］黃荷鳳.瘦素對生殖功能的影響［J］.浙江醫(yī)學(xué)，2002，24〔4〕：198.［7］趙詠桔，陸潔莉，唐金鳳