生化藥物與基因工程藥物分析

關(guān)于生化藥物與基因工程藥物分析第1頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

第一節(jié)概述

第2頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

第一節(jié)概述

第一代生物藥物：生物體某些天然活性物質(zhì)加工制成，例如胎盤制劑第二代：利用生化技術(shù)從生物材料中分離、純化獲得的，例如純化胰島素第三代：利用生物技術(shù)生產(chǎn)的天然生化物質(zhì)及經(jīng)過生物工程手段改造的新物質(zhì)第3頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五一、生物藥物的概念利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合應(yīng)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制的的一類藥物廣義：從動(dòng)物、植物、微生物等生物體中制取的各種天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物第4頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（一）生化藥物：利用生物化學(xué)的理論、方法和技術(shù)，從動(dòng)物、植物以及微生物等生物體中提取分離的天然活性物質(zhì)，以及這些物質(zhì)及其衍生物的化學(xué)合成、半合成和現(xiàn)代生物技術(shù)制的的產(chǎn)品。例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。第5頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（二）生物技術(shù)藥物生物技術(shù)：利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術(shù)體系，生物技術(shù)作為一種手段可用以研究和開發(fā)新藥。生物技術(shù)藥物（生物工程藥物）：用生物技術(shù)研制的藥物第6頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（三）基因工程藥物先確定對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制蛋白質(zhì)合成過程的基因分離、純化或進(jìn)行人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中不斷繁殖或表達(dá)，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)第7頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（四）生物制品應(yīng)用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物或人源組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病的預(yù)防、治療和診斷的藥品。第8頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五生物制品的分類預(yù)防：菌苗（卡介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、類毒素（破傷風(fēng)類毒素）治療：特異性治療用品（狂犬病免疫球蛋白）、非特異性治療用品（白蛋白）診斷：免疫診斷用品（結(jié)核菌素）第9頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

1.生物體的基本生化成分

來自生物體，參與、調(diào)控和影響人體代謝和生理功能，在某些疾病治療時(shí)具有針對(duì)性強(qiáng)、毒副作用小的特點(diǎn)。部分蛋白質(zhì)藥物，極微量就可產(chǎn)生顯著效果。

2.分子量大:

分子量一般為幾千至幾十萬，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，甚至不確定，分析和檢驗(yàn)困難，常需純度分析和分子量測(cè)定。

二、藥物治療控制的特點(diǎn)第10頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五3.結(jié)構(gòu)難確證：各種技術(shù)

4.全過程的質(zhì)量控制：

對(duì)酸、堿、熱、pH等敏感，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件和鑒定質(zhì)量。基因工程藥物比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的藥物要求更高。

5.生物活性檢查

多肽、蛋白質(zhì)類藥物，除采用理化檢驗(yàn)外，還需采用生物鑒定法證實(shí)其生物活性。

二、藥物治療控制的特點(diǎn)第11頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五6.安全性檢查

熱源檢查、過敏實(shí)驗(yàn)、致突變實(shí)驗(yàn)

7.效價(jià)（含量）測(cè)定：

理化法：生物藥物和基因工程藥物

效價(jià)測(cè)定和活性測(cè)定：酶類藥物

二、藥物治療控制的特點(diǎn)第12頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五第二節(jié)質(zhì)量控制的項(xiàng)目和方法來源和種類性狀鑒別檢查含量測(cè)定第13頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

一、鑒別試驗(yàn)

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鑒別法：酶法

電泳法

樣品脫鹽后等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定

生物鑒別法：血清學(xué)法

生物學(xué)法第14頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（一）理化鑒別法

1.化學(xué)鑒別法：

例：溶菌酶+Cu2+絡(luò)合顯色第15頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

2.紫外分光光度法

最大吸收波長(zhǎng)固定不變，紫外光譜圖一致

溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉濃度：20μg/ml

判斷：λmax：257±1nm

3.HPLC法：

利用對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。

第16頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

（二）生化鑒別法1.酶法：例：尿激酶的鑒別氣泡上升法原理：第17頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

方法：取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時(shí)。反應(yīng)系統(tǒng)在30～40秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時(shí)，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在2小時(shí)內(nèi)不溶。第18頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五2.電泳法：帶電荷的供試品在惰性支持介質(zhì)中，與電場(chǎng)的作用下，按各自的速度向其對(duì)應(yīng)的電極方向泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶。第19頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五2.電泳法：以肝素鑒別為例。與國(guó)家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置相應(yīng)。第20頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五3.

樣品脫鹽后等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定基因工程藥物等電點(diǎn)不一致同一產(chǎn)品，不管有幾個(gè)等電點(diǎn)，批與批之間必須一致第21頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（三）生物鑒別法1.血清學(xué)法體外的抗原抗體試驗(yàn)。經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補(bǔ)給結(jié)合反應(yīng)免疫擴(kuò)散、免疫電泳以及熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等高敏感的檢測(cè)技術(shù)第22頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

2.生物法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。第23頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五

一般雜質(zhì)檢查：氯化物、硫酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度等特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析和生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查二雜質(zhì)檢查第24頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（二）特殊雜質(zhì)檢查1.原料藥的純度分析多糖類純度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋白質(zhì)2.生成過程中雜質(zhì)的檢查有傳統(tǒng)生產(chǎn)方法不可能存在的有害雜質(zhì)，如內(nèi)毒素、致敏原第25頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥

物或經(jīng)水解后變成小分子的

藥物。

生物效價(jià)或酶活力單位：適用于酶類、

蛋白質(zhì)類藥物。

三、含量（效價(jià)）測(cè)定第26頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五第三節(jié)定量分析方法理化分析法生化測(cè)定法生物檢定法第27頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五一、理化分析法（一）化學(xué)分析法重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質(zhì)或化合物的重量測(cè)定所含成分的含量。滴定分析法：根據(jù)生物制品中某些成分能與標(biāo)準(zhǔn)溶液定量的發(fā)生酸堿中和反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等特性，通過滴定過程而進(jìn)行生物制品的含量測(cè)定的方法第28頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（二）電化學(xué)分析法電化學(xué)分析法：建立在物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上的一類儀器分析方法，通常將試液作為化學(xué)電池的一個(gè)組成部分，根據(jù)該電池的某種電參數(shù)（如電阻、電導(dǎo)、電位、電流、電量或電流-電壓曲線等）與被測(cè)物質(zhì)的濃度之間存在一定的關(guān)系而進(jìn)行測(cè)定的方法。第29頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（三）光譜法1.比色法供試品中某些成分可與顯色劑發(fā)生顏色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺，與標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行同法處理后比較，即可測(cè)定含量。例：蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)第30頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（三）光譜法2.紫外分光光度法：生物制品或相關(guān)的反應(yīng)產(chǎn)物的紫外光譜在某一特征波長(zhǎng)處有最大吸收，且一定的濃度范圍內(nèi)與相應(yīng)的吸光度成正比，則可用于生物制品的含量測(cè)定第31頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（三）光譜法3.熒光分光光度法：利用物質(zhì)吸收較短波長(zhǎng)的光能后發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)特征光譜的性質(zhì)，對(duì)物質(zhì)定性或定量分析的方法?？梢詮陌l(fā)射光譜或激發(fā)光譜進(jìn)行分析。該法靈敏度高(通常比紫外分光光度法高2～3個(gè)數(shù)量級(jí))，選擇性好。第32頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（四）高效液相色譜法具有高效分析、靈敏檢測(cè)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)分離過程中不破壞分離樣品的特點(diǎn)適合于對(duì)高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的生物制品的定量分析第33頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五二、生化分析法

（一）酶法以酶為分析對(duì)象的分析：酶活力測(cè)定法目的是測(cè)酶的活性或活力以酶為分析工具或分析試劑的分析方法：酶分析法主要測(cè)定樣品中酶以外其他物質(zhì)的含量第34頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五1）基本概念：

酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力測(cè)定實(shí)質(zhì)上是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度越快所表示的酶活力越高。

酶反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。

1.酶活力測(cè)定法第35頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五1）基本概念：

酶單位：任何一種酶，在25℃以最適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?、最適當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng)?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位（國(guó)際單位，IU）

1.酶活力測(cè)定法第36頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五1）基本概念：

酶的比活性：為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示。

1.酶活力測(cè)定法第37頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五酶反應(yīng)進(jìn)程曲線縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時(shí)間，曲線斜率表示反應(yīng)速度。從酶反應(yīng)進(jìn)程曲線求得反應(yīng)的初速度。

酶濃度曲線縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度，橫坐標(biāo)為酶量。通過酶濃度曲線檢驗(yàn)反應(yīng)測(cè)定系統(tǒng)是否適宜。

第38頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五2）酶促反應(yīng)的條件及影響因素

底物的濃度：一般選用底物的濃度[S]=100Km。

pH：選用一個(gè)適宜的緩沖離子和離子強(qiáng)度、

適宜的pH值的緩沖系統(tǒng)來控制pH。

溫度：酶反應(yīng)的溫度通常選用25℃、30℃或

37℃，實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在±0.1℃以內(nèi)。

輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些需要

相應(yīng)的輔酶。第39頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五3）測(cè)定方法：取樣測(cè)定法、連續(xù)測(cè)定法取樣測(cè)定法：在酶反應(yīng)開始后不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)底物和產(chǎn)物在化學(xué)性質(zhì)上的差異，用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。連續(xù)測(cè)定法：在反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)監(jiān)測(cè)的方法。第40頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五4）酶活力測(cè)定的方法檢測(cè)方法：紫外-可見分光光度法旋光法熒光分光光度法電化學(xué)測(cè)定法酶偶聯(lián)測(cè)定法離子選擇性電極測(cè)定法等。

第41頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五2.酶分析法

分析對(duì)象是酶的底物、輔酶活化劑、酶的抑制劑。

1.動(dòng)力學(xué)分析法

2.總變量分析法本法又稱為平衡法或終點(diǎn)法。

僅適用于底物的測(cè)定。第42頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五（二）電泳法

電泳法可分為三大類：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、高效毛細(xì)管電泳（HPCE)。

根據(jù)所用支持物的不同分為：紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、PAGE法、SDS法、瓊脂糖凝膠電泳法

第43頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37分，星期五1、自由界面電泳：在一根U形管里的溶液中，同種分子的構(gòu)型及荷電情況基本一致，在電場(chǎng)影響下，它們逐漸密集而與其他電泳遷移率不同的物質(zhì)之間形成明顯的界面。第44頁，共50頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)37