聚乙二醇化蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的結(jié)構(gòu)分析方法

聚乙二醇化蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的結(jié)構(gòu)分析方法摘要近年來(lái)，聚乙二醇修飾技術(shù)已經(jīng)成為改良蛋白藥物最有效的技術(shù)之一，得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。鑒于聚乙二醇本身的特性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，如何使它更好的修飾蛋白并對(duì)修飾后產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定是研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。本文主要就PEG定點(diǎn)修飾的技術(shù)和PEG化蛋白的成分、結(jié)構(gòu)分析方法及各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)作一介紹，并展望了未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。AbstractPolyethyleneGlycol(PEG)modificationtechnologyhasbecomeoneofthemosteffectivetechnologiesinproteindrugs,gettingmoreandmorewidelyusedinrecentyears.Inviewofthecharacteristicsofpolyethyleneglycolitselfandthemultiplestructureofproteins,it’snecessaryanddifficulttoachievebettermodificationandanalysetheModifiedproducts.Inthispaper,wefixedonthePEG-modified-proteintechnologyandcomponents,structuralanalysismethodsandtheadvantagesanddisadvantagesofvariousmethodstomakeapresentationandprospectthefuturetrendofdevelopment.關(guān)鍵詞：蛋白類(lèi)藥物，聚乙二醇化，修飾位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)分析方法Keywords:Proteindrugs,Peginterferon,modificationsites,structureanalysismethods.正文藥物的聚乙二醇修飾即聚乙二醇化，是將活化的聚乙二醇通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)到蛋白、多肽、小分子有機(jī)藥物和脂質(zhì)體上。藥物的聚乙二醇修飾可分為兩個(gè)階段。第一階段的修飾技術(shù)局限于應(yīng)用相對(duì)分子質(zhì)量低的單甲氧基聚乙二醇(<20000)。常用的修飾劑有單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯(mPEG-SS)、單甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亞胺酯(mPEG-SC)等，通過(guò)酯鍵或三嗪環(huán)將聚乙二醇與藥物分子偶聯(lián)，這種非特異性的不穩(wěn)定連接方式使得一個(gè)藥物分子經(jīng)常連接數(shù)個(gè)聚乙二醇分子【1】。但第一代聚乙二醇修飾藥物通常表現(xiàn)出不穩(wěn)定性、較大的毒性和免疫原性，生物活性、藥代動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)與原型藥物沒(méi)有本質(zhì)的改變。以應(yīng)用相對(duì)分子質(zhì)量高(>20000)聚乙二醇修飾劑為特征的第二階段的修飾技術(shù)具有連接穩(wěn)定、定點(diǎn)修飾、控釋等特點(diǎn)，修飾后的藥物具有更高的生物活性、更好的物理及熱穩(wěn)定性、更高的產(chǎn)品均一性和純度。但總得說(shuō)來(lái)，蛋白藥物PEG修飾技術(shù)中最大的問(wèn)題就是無(wú)法實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾，修飾產(chǎn)物不均一，給分離純化帶來(lái)很大難度，也很大程度上阻礙了臨床應(yīng)用。根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸性質(zhì)和PEG衍生物的特點(diǎn)，科研人員開(kāi)發(fā)了多種定點(diǎn)修飾的策略和方法。1修飾氨基多肽蛋白質(zhì)分子參與PEG化反應(yīng)的基團(tuán)常為a-和￡-氨基，因此用于修飾氨基的單甲氧基聚乙二醇衍生物(mPEGs)種類(lèi)較多，可分為烷基化mPEGs和?；痬PEGs兩大類(lèi)。烷基化mPEGs,包括mPEG-醛、mPEG-三氟乙磺酸及mPEG-環(huán)氧化物等。其中mPEG-醛的修飾條件溫和，交聯(lián)時(shí)不引入其他活性基團(tuán)，在低pH下僅修飾N-末端氨基，對(duì)活性影響較小，同時(shí)方便產(chǎn)物的純化和鑒定，已用于G-CSF、IFN及CD4-IgG等的修飾【2】。mPEG-三氟乙磺酸的修飾條件也較溫和，對(duì)GM-CSF修飾后使其保持較好活性。mPEG-環(huán)氧化物雖制備簡(jiǎn)單,但偶聯(lián)物含活性羥基，易發(fā)生其他交聯(lián)反應(yīng)，修飾率也較低。酰基化mPEGs,包括mPEG-琥珀酰亞胺酯和mPEG-苯并三唑碳酸酯，這兩種修飾劑可優(yōu)先與賴(lài)氨酸殘基反應(yīng),也可與組氨酸和酪氨酸殘基反應(yīng)。此外,mPEG-硝基苯碳酸酯、mPEG-三氯苯碳酸酯及mPEG-氧羰基咪唑比前述兩種反應(yīng)活性低,但修飾專(zhuān)一性較好。2基于氨基保護(hù)的定點(diǎn)修飾對(duì)于蛋白中含有多個(gè)修飾位點(diǎn)，可以利用氨基保護(hù)試劑對(duì)修飾后會(huì)導(dǎo)致蛋白失活嚴(yán)重的位點(diǎn)實(shí)施保護(hù)，對(duì)活性高的修飾位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾后,再將保護(hù)試劑去除。Youn等【3】研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)由于蛋白水解和腎小球過(guò)濾作用，其在體內(nèi)的半衰期非常短，無(wú)法有效發(fā)揮藥效，因此選擇PEG修飾技術(shù)解決這些問(wèn)題。但是在該蛋白序列上，有3個(gè)修飾位點(diǎn)(Try1,Lys12和Lys21)，其中修飾第21位賴(lài)氨酸的氨基可以使蛋白保持最高的生物活性，因此，將1位Try和12位Lys的氨基進(jìn)行92芴甲氧羰基(FMOC)修飾保護(hù)后,用活化mPEG修飾21位Lys獲得定點(diǎn)修飾蛋白，然后再將FMOC去除。這樣既能保持生物活性,又能獲得半衰期長(zhǎng),穩(wěn)定的蛋白藥物。。3修飾羧基有一些蛋白的N端對(duì)其生物活性起著重要作用，如果在N端實(shí)施PEG修飾則會(huì)使蛋白的生物活性喪失，因此將PEG修飾的位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至C端則是一種有效的修飾策略。一般選用mPEG-酰肼或mPEG-胺對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，羧基的修飾位點(diǎn)包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。mPEG-酰肼是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的又一種可與羧基特異性結(jié)合的修飾劑。4修飾巰基與賴(lài)氨酸相比，半胱氨酸在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)幾率和數(shù)量很少，利用具有巰基反應(yīng)活性PEG衍生物就可以實(shí)現(xiàn)蛋白定點(diǎn)修飾,但缺點(diǎn)是半胱氨酸的巰基通常處于蛋白的活性中心，修飾后會(huì)使蛋白活性損失較大。對(duì)于沒(méi)有半胱氨酸的蛋白則可以通過(guò)基因工程手段引入巰基反應(yīng)位點(diǎn)。這一方法不但能夠?qū)崿F(xiàn)高度選擇性修飾,而且能夠減少蛋白生物活性的喪失，并降低免疫原性【4】。目前可用于巰基修飾的mPEGs包括mPEG-馬來(lái)酰亞胺、mPEG-鄰毗啶-二硫醚、mPEG-乙烯基颯及mPEG-碘乙酰胺等。其中mPEG-馬來(lái)酰亞胺制備簡(jiǎn)單，應(yīng)用較多。PEG-鄰毗啶-二硫醚與蛋白質(zhì)偶聯(lián)形成的S-S鍵，在生理?xiàng)l件下可緩慢水解，釋放出天然蛋白質(zhì)，有利于活性的恢復(fù)，但修飾率低°PEG-乙烯基颯在pH7-9范圍內(nèi)可選擇性的與巰基反應(yīng)，當(dāng)pH較高時(shí)則與氨基交聯(lián)°PEG-碘乙酰胺的優(yōu)勢(shì)在于經(jīng)強(qiáng)酸水解后，可釋放出半胱氨酸衍生物，易于鑒定。5二硫鍵定點(diǎn)修飾對(duì)蛋白中含有的二硫鍵進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾分為2個(gè)步驟:首先利用溫和的還原劑使二硫鍵還原釋放兩個(gè)硫氫基;第二步通過(guò)PEG修飾劑的雙烷基化反應(yīng)重建二硫鍵，從而完成PEG的定點(diǎn)修飾。在修飾蛋白過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)蛋白的不可逆變性,而且二硫鍵還原后蛋白仍維持其三級(jí)結(jié)構(gòu),PEG選擇性的修飾兩個(gè)硫基,PEG的立體屏障作用確保1個(gè)二硫鍵只結(jié)合1分子PEG。但是二硫鍵PEG修飾可能會(huì)由于PEG的屏蔽作用，降低蛋白的生物活性。Veronese等【5】利用變性劑鹽酸胍(3mol/L)使蛋白部分變性,高級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，但不使用還原劑以保護(hù)二硫鍵，在非折疊狀態(tài)下完成PEG修飾后，通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾色譜的方法去除變性劑,使蛋白重新正確折疊恢復(fù)生物活性。6非極性氨基酸定點(diǎn)修飾通常只有具有極性的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)才能夠進(jìn)行PEG化學(xué)修飾。Deiters等開(kāi)發(fā)了一種定點(diǎn)修飾非極性氨基酸苯丙氨酸的方法，首先用疊氮化物通過(guò)親核取代反應(yīng)修飾蛋白質(zhì)中的苯丙氨酸生成對(duì)位疊氮化苯丙氨酸,再用炔烴衍生的PEG-酰胺修飾劑修飾苯丙氨酸,發(fā)生環(huán)化加成反應(yīng)形成穩(wěn)定的連接體，從而完成對(duì)蛋白的定點(diǎn)修飾。另外，通過(guò)基因重組在蛋白質(zhì)中引入含疊氮基團(tuán)的氨基酸殘基，再與特定PEG修飾劑偶聯(lián)形成穩(wěn)定的定點(diǎn)單修飾產(chǎn)物。Cazalis【7】通過(guò)基因工程方法在血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin)的C端引入疊氮蛋氨酸,與mPEG2三芳基膦(mPEG2triarylphosphine)修飾劑生成穩(wěn)定的單修飾物，盡管該方法比較復(fù)雜，但至少給我們提供了一個(gè)新的PEG修飾蛋白的思路。7糖蛋白中糖基定點(diǎn)修飾此類(lèi)PEG定點(diǎn)修飾的原理是:首先用葡萄糖氧化酶或高磺酸鈉氧化糖類(lèi)殘基產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的醛基，這些醛基可與mPEG2肼衍生物反應(yīng)生成腙或與mPEG2胺衍生物反應(yīng)生成可逆的Schiff堿。用硼氫甲腈鈉可將腙還原為更穩(wěn)定的烷基肼化物，而Schiff堿可以還原為仲胺。相對(duì)于mPEG-胺衍生物修飾,PEG-肼衍生物修飾不會(huì)形成交聯(lián)聚合體,更適合于糖基的修飾,最有代表性的mPEG2肼衍生物是mPEG2酰肼(hydrazide2mPEG)。酰肼基團(tuán)極低的pKa值使得酰肼基團(tuán)在酸性環(huán)境下(pH4.5?5.0)中仍可以和羧基結(jié)合，而蛋白質(zhì)中的氨基在該條件下由于發(fā)生質(zhì)子化而不能與羧基反應(yīng)，從而可實(shí)現(xiàn)選擇性定位修飾。由于蛋白種類(lèi)多樣和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，往往會(huì)使得PEG修飾反應(yīng)特異性不強(qiáng),反應(yīng)條件要通過(guò)大量試驗(yàn)優(yōu)化。如果能夠利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)品體結(jié)構(gòu)表面性質(zhì)進(jìn)行理論計(jì)算和分析，確定可能的反應(yīng)位點(diǎn)和基團(tuán)，并根據(jù)被修飾基團(tuán)與修飾劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)合適的連接物，這樣不但可以減少PEG修飾的盲目性，而且能夠提高研究效率。胡遠(yuǎn)東等【8】利用Insightll分子模擬軟件包(BiosymInc.,SanDiego,CA)對(duì)牛血紅蛋白品體(bHb)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和分子模擬,計(jì)算了蛋白表面24個(gè)可進(jìn)行PEG修飾的Lys殘基及其主要原子的溶劑可及表面積，確定了其中可以進(jìn)行修飾的13個(gè)Lys殘基(溶劑可及表面積＞0.4nm2)，并進(jìn)一步設(shè)計(jì)了具有雙功能基團(tuán)的小分子化合物環(huán)氧乙烷基活化PEG作為連接體。結(jié)果表明,PEG修飾的bHb的攜氧能力和免疫原性等生物學(xué)指標(biāo)均達(dá)到預(yù)期結(jié)果。聚乙二醇修飾的鑒定與檢測(cè)PEG分子存在一定的相對(duì)分子質(zhì)量分布，因此,PEG修飾的多肽蛋白質(zhì)無(wú)精確理論相對(duì)分子質(zhì)量。此外，蛋白質(zhì)表面可修飾的氨基位點(diǎn)較多難于實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾，從而使PEG修飾的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步復(fù)雜化?？傊鞍踪|(zhì)與聚乙二醇反應(yīng)后的產(chǎn)物是混合物，即使是相同修飾度的蛋白質(zhì)分子之間也會(huì)因修飾位點(diǎn)的不同而呈現(xiàn)多態(tài)性。這種多態(tài)性給聚乙二醇修飾的多肽蛋白質(zhì)的分析帶來(lái)較大困難。PEG化蛋白質(zhì)的檢測(cè)與分析至少應(yīng)該有三個(gè)方面(1)蛋白的平均修飾度(2)PEG修飾的位點(diǎn)及特定位點(diǎn)被修飾程度(3)不同修飾度的蛋白質(zhì)的相對(duì)含量其中PEG修飾的特定位點(diǎn)及特定位點(diǎn)被修飾程度的檢測(cè)目前研究的還比較少，不成熟?，F(xiàn)將幾種常用的檢測(cè)分析方法介紹如下：1分光光度法和熒光胺法來(lái)檢測(cè)聚乙二醇修飾程度自從1960年Satake等介紹用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法測(cè)定蛋白質(zhì)氨基濃度以來(lái)，該方法已成為測(cè)蛋白質(zhì)修飾度最常用的方法。TNBS與蛋白質(zhì)反應(yīng)，蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸殘基的氨基末端進(jìn)攻TNBS的磺酸基，并將其取代，形成的復(fù)合物有特定的光吸收，以此測(cè)定其含量。該方法簡(jiǎn)單易行，但該方法存在如下缺陷：(1)TNBS與蛋白質(zhì)反應(yīng)受pH影響較大所以實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先測(cè)定最佳pH；(2)對(duì)于較小的蛋白質(zhì)該方法精確度不高。Stock等采用熒光胺法測(cè)定修飾度。熒光胺與蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸殘基的氨基末端發(fā)生反應(yīng)生成的產(chǎn)物有特定的光吸收，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)混合物所激發(fā)的熒光值來(lái)測(cè)定其平均修飾度。巰基的測(cè)定也可采用DTNB分析法。

該方法靈敏性很高，僅需納克級(jí)的蛋白質(zhì)就能完成。比如國(guó)內(nèi)有人米用TNBS法和熒光胺法來(lái)測(cè)定聚乙二醇化天花粉蛋白(PEG-TCS)的修飾度【9】。［圖1：TNBS法測(cè)定PEG-TCS修飾度所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,PEG修飾率%=1-(修飾蛋白的斜率/未修飾蛋白的斜率)*100%］［圖2：熒光胺法測(cè)定PEG-TCS修飾度所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線］0048ProteinConcentration(1^g/ml)圖(0048ProteinConcentration(1^g/ml)圖(1)8U8S巖onMBAnEpg此外，較為精確的方法是用一端連有正亮氨酸(norleucine)或熒光素(fluorescein)的PEG分子修飾蛋白質(zhì)，通過(guò)測(cè)定這些標(biāo)記物的含量來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)偶聯(lián)的PEG個(gè)數(shù)，但這類(lèi)方法所用的PEG衍生物較昂貴，不適于常規(guī)分析。色譜法如果用色譜法可以將聚乙二醇反應(yīng)后的混合物逐一分離，則可以繪制隨濃度變化的工作曲線，根據(jù)工作曲線來(lái)為各個(gè)組分定性及定量從而確定混合物的平均分子量和平均修飾度。Snider等分別利用高效離子交換色譜高效體積排阻色譜、高效反相液相色譜等對(duì)PEG-SOD作分析，結(jié)果顯示其分辨率很低，不能將各種分子逐一分析，譜帶寬且雜亂。Mcgoff用體積排阻色譜對(duì)PEG化的SOD進(jìn)行分析，SOD為一尖銳的峰。而PEG化的SOD則為一寬峰而且不能分離完全。但對(duì)于修飾位點(diǎn)少的蛋白質(zhì)或多肽而言色譜法效果較好。如BrianFenton等用RP-HPLC對(duì)PEG-Hirudin(水蛭素)分析由于水蛭素只有三個(gè)修飾位點(diǎn)其產(chǎn)物較少可以很清楚的看出有三個(gè)峰分別為PEG-Hirudin(PEG)，2-Hirudin(PEG)，3-Hirudin【10】。同樣，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究人員利用單甲基化的PEG一丙酸琥珀酰亞胺(mPEG—SPA)對(duì)水蛭素(hirudin，HV)進(jìn)行化學(xué)修飾，采用反相高效液相色譜

（RP-HPLC）法對(duì)水蛭素的PEG修飾產(chǎn)物進(jìn)行分析分離【11】。mPEG—SPA和水蛭素摩爾比為分別為0.5：1和1：1的前提下，反應(yīng)產(chǎn)物的各組分均能實(shí)現(xiàn)基線分離，說(shuō)明其適用范圍較寬，能夠保證在修飾反應(yīng)條件發(fā)生變動(dòng)時(shí)對(duì)產(chǎn)物中各組分的有效分析分離。（下圖是mPEG-SPA和水蛭素摩爾比為1：1的反應(yīng)產(chǎn)物的RP-HPLC譜圖；A和B分別為不同批次樣品）40,28%41.21%

PEGTVp皿HV1451%

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PEG3-HV r"|"|111|'111|111.111|111.111| pil|lll|lll|lll|lll|lipilll. !ir c..|.n.|.n|...|3|..p..（...|].rF... 揖41峋瓠世gItt"?；騔Q鹽MM肌地！UO眥BIM。他 如耽打幗低5，■軾M攻卻*飄用抽苦1好料恥皿就皿恤 M凝膠滲透色譜（GPC）屬于凝膠色譜的一種，凝膠色譜以多孔性填料為固相填料上有許多大小不一的孔徑據(jù)樣品的尺寸大小實(shí)現(xiàn)分離以有機(jī)溶劑（如甲苯四氫呋喃等）為流動(dòng)相的稱(chēng)為凝膠滲透色譜，以水溶液為流動(dòng)相的稱(chēng)為凝膠過(guò)濾色譜，有機(jī)相能很好的溶解大分子PEGBullok等用堿水解使蛋白質(zhì)與PEG分離再對(duì)水解下來(lái)的PEG進(jìn)行凝膠滲透層析通過(guò)測(cè)定PEG的量以測(cè)修飾度【12】。但該方法可能因?yàn)樗獠粡氐缀蜆悠分泻杏坞x的PEG而受干擾SDS凝膠電泳法凝膠電泳是蛋白質(zhì)分析中十分常用的方法，其分辨率高且可以測(cè)定分子量，但該法在測(cè)定PEG化蛋白質(zhì)的分子量方面卻存在很多缺陷。由于PEG在蛋白質(zhì)表面的屏蔽作用和PEG分子與凝膠分子的纏繞作用使PEG化的蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移速度減慢，測(cè)出的分子量偏大。Kurfurst用常規(guī)的電泳法測(cè)定PEG修飾后的水蛭素分子量，結(jié)果比理論值大一倍以上。用碘化鋇將PEG染色，根據(jù)PEG標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定分子量，其值要準(zhǔn)確的多。Kurfurst還用等電聚焦法分析PEG修飾后的水蛭素，也證明有三種物質(zhì)：Hirudin，PEG-Hirudin，（PEG）2-Hirudin。另外，用毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)PEG化蛋白質(zhì)的分析也屢見(jiàn)報(bào)道。由于蛋白質(zhì)的疏水作用、靜電作用和其它多種兩相分配機(jī)制，毛細(xì)管中的蛋白質(zhì)容易吸附在管壁上，尤其是堿性蛋白質(zhì)的靜電吸附最為突出，這樣使毛細(xì)管電泳的分離效率下降，峰高降低甚至不出峰。為克服蛋白吸附，常采用化學(xué)方法來(lái)消除或覆蓋管壁上的硅羥基，使石英表面轉(zhuǎn)化成高分子涂層。Cunico等通過(guò)改性劑使毛細(xì)管柱內(nèi)壁帶正電荷，電滲流從通常的正極到負(fù)極方向變?yōu)樨?fù)極到正極方向，減少了蛋白在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附，同時(shí)也提高了分離度【13】。其它方法紅外光譜也是鑒別化合物、確定分子結(jié)構(gòu)常用的手段之一，對(duì)單一組分或混合物中各組分也可以進(jìn)行定量分析，由于拉曼散射光的頻率位移對(duì)應(yīng)于分子的能級(jí)躍遷。Bullock[i4]等報(bào)道，紅外光譜測(cè)定相對(duì)而言較為快速直接，不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以根據(jù)C-O-C鍵的吸收強(qiáng)度給聚乙二醇定量，但必須假設(shè)連接了SOD和沒(méi)有連接SOD的聚乙二醇的C-O-C鍵的吸收強(qiáng)度相同。另外，由于紅外光譜對(duì)PEG-SOD中的PEG沒(méi)有特征吸收，所以游離PEG的量需要用GPC法檢測(cè)并扣除。而且，該方法確定修飾度還需要知道精確的蛋白質(zhì)含量，這也可能成為誤差來(lái)源。還可以采用核磁共振（NMR）測(cè)定C14標(biāo)記的PEG修飾蛋白的平均修飾度[15]。Banci等用NMR測(cè)定了鉆鹽取代的聚乙二醇修飾銅鉆超氧化物岐化酶的H1質(zhì)子譜圖，發(fā)現(xiàn)該酶活性位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到修飾反應(yīng)的破壞。另外，光散射法，雙水相萃取分離分析法等也被用于分析，不再一一贅述。聚乙二醇化位點(diǎn)的鑒定蛋白質(zhì)類(lèi)藥物PEG化位點(diǎn)鑒定的一般方法是以天然蛋白質(zhì)作對(duì)照，用蛋白酶（如胰蛋白酶）水解，由缺失的肽片段來(lái)推斷PEG化位點(diǎn)。但該方法存在一定缺陷，易出現(xiàn)鑒定誤差oVeroneseFM等采用一種新的PEG衍生物，可解決鑒定差的問(wèn)題，即用經(jīng)琥珀酰亞胺酯活化的氨基酸（Met-Nle或Met-。-Ala）作為連接鍵,偶聯(lián)物經(jīng)BrCN裂解可得到與Nle或。-Ala相連的蛋白質(zhì)經(jīng)常規(guī)分析（如氨基酸分析、Edman降解法）可以確定Nle或p-Ala連接位點(diǎn)，進(jìn)而確定PEG化位點(diǎn)。質(zhì)譜法質(zhì)譜法是測(cè)定物質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段。VestlingMM等【16】對(duì)PEG修飾后的超氧化物歧化酶（SOD）進(jìn)行水解，采用串聯(lián)質(zhì)譜（tandeMS）測(cè)定其肽圖，以判斷修飾位點(diǎn)及修飾程度。近年來(lái)，一種新型的質(zhì)譜方法-基體輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）被成功地用于PEG修飾蛋白組分的定性與定量分析。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)品薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比。該質(zhì)譜最大特點(diǎn)是可以分析高分子量的生物大分子，被測(cè)分子量可達(dá)50萬(wàn)道爾頓。ChulYoo【17】等利用基于MALDIMS的多種技術(shù)來(lái)鑒定分析一種的含31個(gè)殘基并且其賴(lài)氨酸的支鏈被20kDa線性PEG修飾的多肽（預(yù)期設(shè)計(jì)）。序列為：Ac-WVTHR*LAGLLSR*SGGVVK*K19NFVPTDVGPXAF-NH2，R*為瓜氨酸、K*為高精氨酸、X為萘-丙氨酸。214S.J13075&3m/z(Da)2500154g1^2U144IS1^11 C12［湖阻\AT2SQ亡y1207.^3Eld■*-V—t-GW=—Ft+r-i—,:—|214S.J13075&3m/z(Da)2500154g1^2U144IS1^11 C12［湖阻\AT2SQ亡y1207.^3Eld■*-V—t-GW=—Ft+r-i—,:—| R'-109^.121*2IT1S51J07cIT洵m1+2272640z*2?32ATS21*230■部1*is4*221泓1.砧Z?21&￡25Z*22924104^195517304-7.932021a?5Z+22D25?57族3甜七20踽1*27B3.7DZ422B上圖是放大的reISD（反射式源衰變）光譜，具有3490.87Da的[M+H]+峰，同時(shí)可觀察到大量的c-,y-,[z+2]型的碎片信號(hào)。利用ISD（源衰變）序列分析和高精氨酸可以測(cè)得完整的序列范圍，未被修飾的19-賴(lài)氨酸殘基也可通過(guò)此光

譜準(zhǔn)確無(wú)誤的鑒定。其它的利用MALDI-MS的斷裂技術(shù)，如CID（collision-induceddissociation）或源后衰變（PSD），除了常見(jiàn)的b-和y-系的碎片離子外，還會(huì)導(dǎo)致過(guò)度退化的a-,d-,v,和w-系的碎片產(chǎn)物。當(dāng)遇到更高的分子量時(shí)，由于不穩(wěn)定的肽鍵大多被離解CID讀出的數(shù)據(jù)并不可靠。而ISD能夠均勻的穿過(guò)序列，產(chǎn)生相對(duì)簡(jiǎn)單的碎片離子圖譜，主要是c-，（z+2）系的碎片離子，它們是由肽鏈骨架的N-Ca鍵斷鏈形成的。然而，基于ISD的MALDI-TOFMS其實(shí)是一種“假M(fèi)S/MS”技術(shù)，具有與前體離子選擇不相符的內(nèi)源碎片。這要求樣品要高度純凈或者ISD-MALDIMS連有離線色譜分離（裝置）。—KS4GIGI-V-FVH—Ka—1卜FANT2021.10￡181359.61

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c1T■scooFigure4.relSEJ-MALDIMSspectrumobtainedforthePEGylatedpeptide(R*forcitrulline;K*forhomoAre).Matchingfraementionsareassigned.上圖是將上述質(zhì)子化的PEG化多肽的所獲得的ISD光譜。所有的碎片離子都以質(zhì)子化的形式呈現(xiàn)，有c-和y-系。如同質(zhì)子化的單體多肽那樣，它們顯示出清晰的裂解譜。但是，PEG化多肽的離子系分別在19-賴(lài)氨酸，c18和y12處被截?cái)唷＿@種特定的截?cái)嘧饔?，可以有力的指示修飾發(fā)生在19-賴(lài)氨酸處，即這就是PEG化的位點(diǎn)。此處，PEG部分由于分子量過(guò)大（20KD）不能被reISD光譜監(jiān)測(cè)。基于其極高的精度和reISD產(chǎn)生的范圍從10000到20000的碎片峰，這一技術(shù)以足夠用以探測(cè)，定位和指示修飾作用引發(fā)的分子質(zhì)量微小的改變。此實(shí)驗(yàn)中，PEG作為一個(gè)大的雜分子與19-賴(lài)氨酸連接，使此處的質(zhì)譜測(cè)序

信息丟失。蛋白質(zhì)被修飾的側(cè)鏈所產(chǎn)生的碎片，如磷酸鹽，聚糖或二硫鍵是不能通過(guò)ISD,ECD,ETD光譜觀察到的，離子系在19-賴(lài)氨酸處的截?cái)嗯c預(yù)測(cè)相符。這與二硫鍵鑒定和毗咯氨酸的情況類(lèi)似。同樣的由于環(huán)狀部分的存在，序列測(cè)定時(shí)會(huì)丟失此處的信息。實(shí)驗(yàn)用到的模型相對(duì)簡(jiǎn)單，適合于直接的分析。它基本上只含有單一潛在的PEG化位點(diǎn)，其N(xiāo)-末端被乙酰化，并且對(duì)常用的PEG化化學(xué)試劑不敏感。然而，當(dāng)對(duì)象復(fù)雜性較高，就需要進(jìn)一步的研究來(lái)保證這種方法能夠辨別不同的PEG化位點(diǎn)和定量各自的修飾度。可見(jiàn)，MALDI-TOF-MS具備了足夠高的分辨率，能夠鑒別出這種混合態(tài)PEG化多肽中的每一種寡聚物成分。而經(jīng)典的ESI-MS光譜則顯得非常復(fù)雜且不能鑒定這一分子。利用MALDI-TOFMS進(jìn)行反射源衰變（relSD）分析是為了在樣品未經(jīng)任何處理，分子完好無(wú)損的情況下來(lái)鑒定聚乙二醇化的位點(diǎn)。自從20世紀(jì)70年代以來(lái)，已有十余種PEG修飾的蛋白藥物上市，，表現(xiàn)出優(yōu)良的臨床效果，還有PEG-水蛭素等多種藥物正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段針。但仍有許多蛋白藥物由于常規(guī)的多點(diǎn)修飾不能得到理想的效果，因此隨著PEG修飾蛋白技術(shù)研究的不斷深入，已從原來(lái)的多點(diǎn)隨機(jī)修飾向定點(diǎn)單修飾發(fā)展，由復(fù)雜的多單元操作向便捷高效的集成操作發(fā)展，提高了修飾蛋白的生物活性，降低了PEG修飾的成本，擴(kuò)大了PEG修飾技術(shù)的應(yīng)用范圍。鑒于蛋白質(zhì)類(lèi)藥物本省的理化特性，只有根據(jù)其不同性質(zhì)綜合考慮，選擇合適的PEG修飾技術(shù)才能起到良好的效果。對(duì)不同的酶多肽或蛋白選擇適宜的PEG活化和偶聯(lián)方式以及相應(yīng)的產(chǎn)物分離與結(jié)構(gòu)分析檢測(cè)的各種方法都有其適用范圍和局限性至今還沒(méi)有通用的方法可供選擇［18。］對(duì)被修飾蛋白的修飾度及結(jié)構(gòu)的測(cè)定仍是該類(lèi)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的核心與難點(diǎn)。隨著PEG修飾技術(shù)和分析技術(shù)的研究的不斷深入，先進(jìn)儀器的出現(xiàn)以及不同檢測(cè)方法的聯(lián)合運(yùn)用必將進(jìn)一步提高聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的特異性從而使產(chǎn)物的分離純化和分析檢測(cè)更加簡(jiǎn)單易行，這也是PEG修飾技術(shù)發(fā)展的必然要求。參考文獻(xiàn)張修建，王清明，陳惠鵬.藥物的聚乙二醇修飾研究進(jìn)展.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)[J].2003,19(3):213-216.秦海娜，修志龍?聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的活化與檢測(cè)方法.化學(xué)通報(bào)[J].2003,66:1-10YounYS,LeeKC.Site2specificPEGylationforhigh2yieldpreparationofLys(21)-aminePEGylatedgrowthhormone-releasingfactor(GRF)(1-29)usingaGRF(1-29)derivativeFMOC-protectedatTyr(1)andLys(12).BioconjugChem[J],2007,18(2):500-506.YuP,ZhengC,ChenJ,etal.InvestigationonPEGylationstrategyofrecombinanthumaninterleukin-1receptorantagonist.BioorgMedChem[J],2007,15(16):5396-5405.WGXing,ZWDong.DiscardedfreePEG-basedassayforobtainingthemodificationextentofpegylatedproteins.Talanta[J].2007,71:381-384.StefanoSalmaso,AlessandraSemenzato,etal.Site-selectiveproteinglycationandPEGylation.EuropeanPolymerJournal[J].2008,44:1378-1389.YuSeokYoun,DongHeeNa,KangChoonLee.High-yieldproductionofbiologicallyactivemono-PEGylatedsalmoncalcitoninbysite-specificPEGylation.Journalofcontrolledrel