生物敏感膜的制備

關(guān)于生物敏感膜的制備第1頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五2第一節(jié)生物敏感膜

敏感膜的構(gòu)成：

膜基體

膜材料

生物敏感材料第2頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五31、膜基體

膜基體是敏感膜的載體，它關(guān)系著有效發(fā)揮敏感材料的作用和膜的壽命，也即生物傳感器的使用壽命。常用的膜基體有：金屬材料，如鉑、金、鈀等；半導(dǎo)體材料，如石英、玻璃、氮化硅、硅、鍺等；有機(jī)材料，如聚氯乙烯、硅橡膠、

纖維素等。第3頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五42、膜材料

膜材料是固化敏感材料成膜的物質(zhì)，是敏感材料的支持物。它必須具有一定的剛性和韌性，要適合于敏感材料的搭載與結(jié)合；它必須具有化學(xué)或物理附著力，以利于固化在膜基體上。第4頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五5膜材料包括有四類：⑴有機(jī)聚合物類：如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氟乙烯、葡聚糖、硅橡膠等；⑵無(wú)機(jī)物類:如多孔玻璃、活性炭、石墨、石英、硫化物、粘土等；⑶天然生物材料類：如瓊脂、動(dòng)植物細(xì)胞膜、卵磷脂等；⑷人工合成的生物材料類：如各種兩親有機(jī)化合物構(gòu)成的雙層脂膜，如磷脂。第5頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五63、生物敏感材料

生物敏感材料是生物傳感器的核心，有人稱它為分子探針。常用的生物敏感材料有：酶、微生物(病毒、細(xì)菌)、動(dòng)植物組織、化學(xué)和生物發(fā)光物質(zhì)、抗體和受體、DNA等生物敏感組分。第6頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五7具體方式有四種：

⑴膜基體——膜材料——敏感材料

⑵膜基體——膜材料＋敏感材料

⑶膜基體（膜材料）——敏感材料

⑷膜基體＋敏感材料第7頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五8第二節(jié)生物敏感材料的

固定化技術(shù)

生物敏感膜的制備技術(shù)就是將生物活性物質(zhì)進(jìn)行固定化的技術(shù)，它是生物傳感器研究的重要內(nèi)容。

第8頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五9

固定化目的：

◆將生物活性物質(zhì)限制在一定的空間，同時(shí)不妨礙底物的自由擴(kuò)散。

第9頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五游離相的生物活性材料固相載體固相生物活性材料（eg：固定化酶）固定化技術(shù)第10頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五11固定化技術(shù)應(yīng)滿足：

◆固化后的生物組分仍能維持良好的生物活性；

◆固定化層要有良好的穩(wěn)定性和耐用性，且能適應(yīng)多種測(cè)試環(huán)境；

第11頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五12

生物敏感物質(zhì)的固定化方法，大致劃分為吸附法、包埋法、夾心法、共價(jià)鍵固定法、交聯(lián)法。第12頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五13一、吸附法

吸附法是用非水溶性載體物理吸附或離子結(jié)合，使生物組分固定在其表面的方法。

包括：物理吸附

離子交換吸附第13頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五14㈠物理吸附法

物理吸附法主要通過(guò)范德華力的作用將生物組分吸附在水不溶性的惰性載體上。

常用載體有多孔玻璃、活性炭、氧化鋁、石英砂、纖維素膜、葡聚糖、瓊脂糖等，

第14頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五15優(yōu)點(diǎn)：

操作簡(jiǎn)便、條件溫和，不會(huì)引起生物組分的變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：對(duì)周圍環(huán)境敏感，結(jié)合力弱，生物組分容易脫落。

第15頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五16（二）離子交換吸附法

選用具有離子交換的載體，使生物組分與離子交換劑通過(guò)離子鍵結(jié)合，形成固定化層。

常用載體有離子交換樹(shù)脂、二乙胺乙基纖維素、四乙胺乙基纖維素、氨乙基纖維素、羧甲基纖維素等。

制備的固定化酶有葡萄糖淀粉酶、膽固醇氧化酶等。

第16頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五離子交換樹(shù)脂的結(jié)構(gòu)具有三維空間立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)骨架聯(lián)接在骨架上的活性基團(tuán)活性基團(tuán)帶有可交換的活性離子第17頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五二、夾心法

將生物活性材料封閉在雙層濾膜之間。

特點(diǎn)：

操作簡(jiǎn)單，不需要任何化學(xué)處理，固定生物量大，響應(yīng)速度快，重現(xiàn)性好，尤其適用于微生物和組織膜的制作。

第18頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五舉例微生物膜制備的一般步驟:①將微生物培養(yǎng)離心，洗滌，懸?。虎跍y(cè)定菌體濃度；③取一定量的菌懸液滴到濾膜上；④將水抽干，使菌體成一薄層均勻附著于膜表面；⑤在菌體層上覆蓋一層透氣膜或微孔濾膜，讓微生物夾在兩層膜之間。第19頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五BOD（生化需氧量）微生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖第20頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五

BOD微生物傳感器的電流響應(yīng)

第21頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五22三、包埋法

包埋法是將生物組分包埋并固定在高分子聚合物三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)中，形成穩(wěn)定生物組分敏感膜。

第22頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五23優(yōu)點(diǎn)：

◆可采用溫和的實(shí)驗(yàn)條件及多種凝膠聚合物；

◆對(duì)生物組分的活性影響較??；

◆可固定高濃度的生物組分,被包埋物不易滲漏等。第23頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五24缺點(diǎn)：

◆分子量大的底物在凝膠網(wǎng)格內(nèi)擴(kuò)散較困難，響應(yīng)速度較慢；

◆若載體是合成凝膠，在聚合物形成過(guò)程中對(duì)生物組分的活性可能產(chǎn)生影響。第24頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五25包埋法包括三種：

聚合物膜包埋法

電聚合物膜包埋法

溶膠-凝膠包埋法

第25頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五26㈠聚合物膜包埋法

將生物組分與聚合物單體混合而使生物組分包埋于其中，制備成具有生物活性的敏感膜。

第26頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五27㈡電聚合物膜包埋法

將聚合物單體和生物活性物質(zhì)同時(shí)混合于電解液中，通電使單體在電極表面氧化而聚合成膜，同時(shí)將生物活性物質(zhì)包埋于聚合物膜內(nèi)，直接固定于電極表面，構(gòu)成生物傳感器。

第27頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五28優(yōu)點(diǎn)：●聚合層厚度和酶量容易控制●修飾層重現(xiàn)性好。第28頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五29㈢溶膠-凝膠膜包埋法⑴溶膠-凝膠(sol-gel)技術(shù)指有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物經(jīng)過(guò)溶液、溶膠、凝膠而固化，再經(jīng)過(guò)熱處理制得氧化物或其它化合物固體的方法。第29頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五30

溶膠（Sol）：是具有液體特征的膠體體系，分散的粒子是固體或者大分子，直徑在1-100nm之間。。凝膠（Gel）：是具有固體特征的膠體體系，被分散的物質(zhì)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。第30頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五31溶膠無(wú)固定形狀粒子自由運(yùn)動(dòng)凝膠固定形狀粒子按一定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定不能自由運(yùn)動(dòng)溶膠與凝膠的結(jié)構(gòu)比較第31頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五溶膠-凝膠的典型例子：豆?jié){（sol）豆腐（gel）第32頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五33（2）溶膠—凝膠的制備

●金屬或半金屬醇鹽在水、互溶劑（一般為醇）及催化劑（酸或堿）發(fā)生水解反應(yīng)，形成羥基化的產(chǎn)物和相應(yīng)的醇。

●未羥基化的烷氧基與羥基或兩羥基間發(fā)生縮合形成膠體狀的混合物，即溶膠，水解和縮合過(guò)程同時(shí)進(jìn)行；

●最后膠粒間發(fā)生聚合、交聯(lián)，使溶膠黏度逐漸增大，形成凝膠。第33頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五34

第34頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五35第35頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五

硅烷聚合物凝膠的立體構(gòu)造

第36頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五37

圖溶膠-凝膠法包埋活性分子的過(guò)程

溶膠—凝膠法包埋生物活性分子通常只是物理結(jié)合過(guò)程。溶膠溶液將活性分子加入溶膠溶液凝膠開(kāi)始形成活性分子被包埋在凝膠中。

第37頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五38（3）溶膠—凝膠法的特點(diǎn)光學(xué)透光性強(qiáng)；無(wú)電化學(xué)降解，具有導(dǎo)電性且易控制；熱穩(wěn)定性好，具有化學(xué)惰性；具有一定的剛性；有足夠的水，為生物組分提供水溶液的微環(huán)境；能均勻地?fù)饺肷锝M分，實(shí)現(xiàn)分子水平上的均勻摻雜。第38頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五39四、共價(jià)鍵固定法

將生物組分通過(guò)共價(jià)鍵與不溶性載體（轉(zhuǎn)換器探頭）結(jié)合而固定的方法稱共價(jià)鍵固定法，或稱載體結(jié)合法。

包括3個(gè)步驟：

●基底電極表面的活化

●生物分子的偶聯(lián)

●剩余價(jià)鍵的封閉及除去鍵合疏松的組分。第39頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五載體修飾需滿足：

●化學(xué)連接穩(wěn)定●連接長(zhǎng)度足夠長(zhǎng)，減小固相表面的空間位阻●不產(chǎn)生非特異性結(jié)合第40頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五41

(1)直接化學(xué)固定法

將基體表面先經(jīng)過(guò)化學(xué)處理或修飾，然后將生物功能物質(zhì)以共價(jià)、離子或配位等方式結(jié)合固定于電極表面。第41頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五42（2）硅烷化-雙功能基團(tuán)試劑偶聯(lián)法

采用硅烷化試劑修飾基體表面，使其帶上氨基或羥基，然后用雙功能偶聯(lián)劑（如戊二醛）與生物活性分子相結(jié)合而使生物組分固定的方法。第42頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五43硅烷化—雙功能基團(tuán)試劑偶聯(lián)法第43頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五44⑶自組裝（Selfassembling，SA）膜法

基于分子的自組裝作用，在固體表面上自然地形成高度有序的單分子層的方法。有些分子通過(guò)化學(xué)鍵相互作用能自發(fā)吸附在固/液和固/氣表面，形成熱力學(xué)穩(wěn)定和能量最低的有序膜。

第44頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五發(fā)生自組裝的條件：

動(dòng)力：提供能量

導(dǎo)向作用：分子在空間的大小和方向上達(dá)到分子重新排列的要求，從無(wú)序到有序的重新重組。自組裝單層膜的形成示意圖第45頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五46自組裝膜的類型：●脂肪酸在金屬氧化物表面●有機(jī)硅烷在羥基化表面(Si02／Si、A12O3／Al、玻璃等)

●硫醇、二硫化物和硫化物在金屬（金、銀、銅）表面或半導(dǎo)體表面第46頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五47自組裝膜的結(jié)構(gòu)：●頭基：與基底表面上的反應(yīng)以共價(jià)鍵或離子鍵結(jié)合。●烷基鏈：表面活性物質(zhì)在固體表面有序緊密地排列。

●末端基團(tuán)：如-CH3，-COOH,-OH,-NH2，-SH。第47頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五載體活化的方法48重氮法疊氮法溴化氰法縮合法烷基化法第48頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五49(1)重氮法

●芳香族伯胺和亞硝酸作用（在強(qiáng)酸介質(zhì)下）生成重氮鹽的反應(yīng)稱為重氮化。重氮基再與酶分子中的-NH2、-OH、-SH、咪唑基等發(fā)生重氮偶聯(lián)反應(yīng)，從而制成固定化酶。

第49頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五第50頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五51●對(duì)纖維素等多糖類不溶性載體,可利用于硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)，一端與纖維素上的羥基進(jìn)行醚化，另一端上的-NH2，經(jīng)NaNO2與HCl重氮化，重氮基再與酶偶聯(lián)。

第51頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五第52頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五53（2）疊氮法

將含羧基的不溶性載體(如羧甲基纖維素、膠原蛋白等)進(jìn)行甲酯化，再與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物,最后與酶上的-NH2偶聯(lián)。第53頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五第54頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五55(3)溴化氫法

將具有-OH的不溶性載體，首先用CNBr活化，形成具有活性的亞胺碳酸衍生物，再與酶上的-NH2偶聯(lián)。第55頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五56第56頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五(4)縮合法（肽鍵法）

酶的-NH2或-COOH與載體的-COOH或-NH2形成肽鍵，從而制得固定化酶。第57頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五58(5)烷基化法

使酶分子中-NH2、-SH、酚基與不溶性載體上的鹵素或乙烯磺酰基發(fā)生反應(yīng)，制成固定化酶；也可以使聚酰胺類化合物先經(jīng)硫酸二甲酯烷基化后，烷氧基再與酶中的-NH2、-SH、酚基等作用，制備固定化酶。

第58頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五含羥基的載體可用鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。第59頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五60㈢交聯(lián)共聚法

借助于交聯(lián)劑(具有兩個(gè)或兩個(gè)以上功能基的試劑)的作用，使酶分子間發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固相酶，也可將酶分子直接與載體共價(jià)交聯(lián)。第60頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五61

共價(jià)鍵結(jié)合法的特點(diǎn)是結(jié)合牢固，蛋白質(zhì)分子不易脫落，載體不易被生物降解，使用壽命長(zhǎng)。缺點(diǎn)是操作步驟比較麻煩，酶活性可能因?yàn)榘l(fā)生化學(xué)修飾而降低，制備具有高活性的固定化酶比較困難。第61頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五62尼龍網(wǎng)酶膜的制備：1）活化尼龍網(wǎng)在硫酸二甲酯中煮沸5分鐘；2）洗滌移入無(wú)水甲醇3）連接氨基轉(zhuǎn)移到賴氨酸溶液中反應(yīng)2h，用NaCl清洗；4）加交聯(lián)劑戊二醛；5）與酶交聯(lián)。第62頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五63五、LB(Langmuir-Blodgett)膜法（一）LB膜

把液面上有序排列的有機(jī)化合物逐層地轉(zhuǎn)移到固定基片上，在分子水平上制造出按有序排列的分子組合體，成為單分子層或幾個(gè)多分子層的修飾薄膜。

第63頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五64（二）LB膜的特點(diǎn)1.膜厚度可精確控制，可精確到納米級(jí)；2.膜內(nèi)分子排列有序而致密，均一性好；3.脂質(zhì)雙層膜同生物膜結(jié)果相似，是理想的仿生膜，具有極佳的生物相容性；4.可把活性物質(zhì)固定在LB膜的預(yù)定位置，制成具有特殊功能的生物傳感器。第64頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五制備LB膜的裝置示意圖

（三）LB膜的制備過(guò)程及制備方式第65頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五制膜過(guò)程示意圖第66頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五67按照轉(zhuǎn)移（掛膜）式電極表面相對(duì)于水面的相對(duì)運(yùn)動(dòng)方向，可將LB膜的制備分為X,Y和Z三種方式。第67頁(yè)，共76頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)58分，星期五68