疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研究課件

第二十四章

疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十四章生物化學(xué)與分子生物學(xué)疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊《寂c基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)變化有關(guān)，都是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。疾病相關(guān)基因

致病基因：一種疾病的表型和一個(gè)基因型呈直接對(duì)應(yīng)的因果關(guān)系，即該基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)的異常是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接原因疾病易感基因：環(huán)境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現(xiàn)為2個(gè)以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對(duì)疾病的易感性疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊〉谝还?jié)

鑒定疾病相關(guān)基因的原則

第一節(jié)一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件

確定疾病的遺傳因素，即通過(guò)孿生子分析，領(lǐng)養(yǎng)分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。

一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基因鑒定克隆策略示意圖二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能夠達(dá)到最終鑒定疾病相關(guān)基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴(lài)其在染色體位置而予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。

三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能第二節(jié)

疾病相關(guān)基因克隆的策略和方法第二節(jié)一、不依賴(lài)染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略

不依賴(lài)染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位點(diǎn)非依賴(lài)的DNA序列信息和動(dòng)物模型來(lái)鑒定和克隆疾病基因。一、不依賴(lài)染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略不依（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢unctionalcloning）采用的是從蛋白質(zhì)到DNA的研究路線(xiàn)，針對(duì)的是一些對(duì)影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病1．依據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關(guān)基因

2．用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因

（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢u（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克隆（phenotypecloning）基于對(duì)疾病表型和基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)的特征聯(lián)系已經(jīng)有所認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上來(lái)分離鑒定疾病相關(guān)基因（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克?。╬hen1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對(duì)產(chǎn)生變異的DNA片段進(jìn)行克隆，而不需要基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。

2.針對(duì)已知基因。如果高度懷疑某種疾病是由于某個(gè)特殊的已知基因所致，可通過(guò)比較患者和正常對(duì)照間該基因表達(dá)的差異來(lái)確定該基因是否為該疾病相關(guān)基因。3.針對(duì)未知基因的，可通過(guò)比較疾病和正常組織中的所有mRNA的表達(dá)種類(lèi)和含量間的差異，從而克隆疾病相關(guān)基因。這種差異可能源于基因結(jié)構(gòu)改變，也可能源于表達(dá)調(diào)控機(jī)制的改變。依據(jù)DNA或mRNA的改變與疾病表型的關(guān)系，可有幾種策略：

1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組D針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplay，mRNA-DD）抑制消減雜交（suppressivesubstractivehybridization，SSH）基因表達(dá)系列分析（SAGE）

cDNA微陣列（cDNAmicroarray）基因鑒定集成法（integratedprocedureforgeneidentification）針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdiffRDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖RDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類(lèi)的部分疾病，已經(jīng)有相應(yīng)的動(dòng)物模型。如果動(dòng)物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位,而具有相似人類(lèi)疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。另外，當(dāng)疾病基因在動(dòng)物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來(lái)定位分離人的同源基因。

（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類(lèi)的部分疾病，已經(jīng)有二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克?。╬ositionalcloning）：僅根據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關(guān)基因。定位克隆的起點(diǎn)是基因定位，即確定疾病相關(guān)基因在染色體上的位置，然后根據(jù)這一位置信息，應(yīng)用DNA標(biāo)記將經(jīng)典的遺傳學(xué)信息轉(zhuǎn)換為遺傳標(biāo)記所代表的特定基因組區(qū)域，再以相關(guān)基因組區(qū)域的相連重疊群（contig）篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差異，確定基因和疾病的關(guān)系。二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克?。╬osit（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基因2．染色體原位雜交是在細(xì)胞水平定位基因的常用方法3.染色體異常有時(shí)可提供疾病基因定位的替代方法4．連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的候選區(qū)域2．構(gòu)建目的區(qū)域的物理圖譜3.疾病相關(guān)基因的確定（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，根據(jù)患病女性X染色體與第21號(hào)常染色體的易位，以及男患兒發(fā)生小的Xp21.2缺失并伴發(fā)三種其他X連鎖隱性遺傳病，再運(yùn)用RFLP連鎖分析將DMD基因定位于Xp21。然后，分別克隆得到了基因的2個(gè)不同的片段，分別命名為XJ系列探針和pERT87系列探針，根據(jù)兩片段的比較，證明DMD基因約為2300kb，占X染色體的1%以上，該基因編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（dystrophin），影響橫紋肌和心肌的結(jié)構(gòu)和收縮功能。假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因組的關(guān)聯(lián)研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）全外顯子測(cè)序（wholeexonsequencing）三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類(lèi)基因組計(jì)劃和多種模式生物基因組測(cè)序的完成,生物信息學(xué)的發(fā)展,計(jì)算機(jī)軟件的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們通過(guò)已獲得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性比較，或?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中不同物種間的序列比較分析、拼接，預(yù)測(cè)新的全長(zhǎng)基因等，進(jìn)而通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從組織細(xì)胞中克隆該基因，這就是所謂的電子克?。╥nsilicocloning）。四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類(lèi)基因組計(jì)劃和第三節(jié)

疾病相關(guān)基因的功能研究第三節(jié)基因的功能實(shí)際是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因RNA的功能，前者是本節(jié)討論的重點(diǎn)?；虍a(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的功能可以從三個(gè)不同水平來(lái)描述：①生物化學(xué)水平，主要描述基因產(chǎn)物參與了何種生化過(guò)程，如屬于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等；②細(xì)胞水平,主要論述基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位和參與的生物學(xué)途徑，例如，某蛋白質(zhì)定位于核內(nèi)，參與DNA的修復(fù)過(guò)程，有可能并不了解確切的生物化學(xué)功能；③整體水平,主要包括基團(tuán)表達(dá)的時(shí)空性及基因在疾病中的作用?；虻墓δ軐?shí)際是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和一、基因比對(duì)及功能詮釋常用的兩大雙序列比對(duì)工具是BLAST和FASTA,分別由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）開(kāi)發(fā)和維護(hù)。NCBI的主頁(yè)是/；EBI的主頁(yè)是http://www.ebi.ac.uk/。

一、基因比對(duì)及功能詮釋常用的兩大雙序列比對(duì)工具是BLAST二、利用工程細(xì)胞研究基因功能

（一）采用基因重組技術(shù)建立基因高表達(dá)工程細(xì)胞系（二）基因沉默技術(shù)抑制特異基因的表達(dá)二、利用工程細(xì)胞研究基因功能（一）采用基因重組技術(shù)建立基因三、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能

在一些情況下,即使對(duì)基因的序列、結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式有清楚的認(rèn)識(shí)，但仍然難以闡明基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能。此時(shí)通過(guò)研究該蛋白質(zhì)與已知功能蛋白質(zhì)的相互作用，無(wú)疑將非常有助于對(duì)該蛋白質(zhì)功能的了解。常用的高通量篩查蛋白質(zhì)間相互作用的方法是酵母雙雜交技術(shù)（見(jiàn)第二十章）和噬菌體展示技術(shù)。三、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能在一些情況下,四、利用基因修飾動(dòng)物整體研究基因功能

盡管在體外對(duì)基因功能的研究可提供大量信息，但是只有在整體內(nèi)的研究才能真實(shí)反映該基因在體內(nèi)的真正作用。通過(guò)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，持別是小鼠體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)的基因操作，獲得基因修飾動(dòng)物品系，已成為在體研究基因功能的重要手段，常用的有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因敲除動(dòng)物。

四、利用基因修飾動(dòng)物整體研究基因功能盡管在體外對(duì)基因功能的第二十四章

疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十四章生物化學(xué)與分子生物學(xué)疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊《寂c基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)變化有關(guān)，都是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。疾病相關(guān)基因

致病基因：一種疾病的表型和一個(gè)基因型呈直接對(duì)應(yīng)的因果關(guān)系，即該基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)的異常是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接原因疾病易感基因：環(huán)境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現(xiàn)為2個(gè)以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對(duì)疾病的易感性疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊〉谝还?jié)

鑒定疾病相關(guān)基因的原則

第一節(jié)一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件

確定疾病的遺傳因素，即通過(guò)孿生子分析，領(lǐng)養(yǎng)分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。

一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基因鑒定克隆策略示意圖二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能夠達(dá)到最終鑒定疾病相關(guān)基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴(lài)其在染色體位置而予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。

三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能第二節(jié)

疾病相關(guān)基因克隆的策略和方法第二節(jié)一、不依賴(lài)染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略

不依賴(lài)染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位點(diǎn)非依賴(lài)的DNA序列信息和動(dòng)物模型來(lái)鑒定和克隆疾病基因。一、不依賴(lài)染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略不依（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢unctionalcloning）采用的是從蛋白質(zhì)到DNA的研究路線(xiàn)，針對(duì)的是一些對(duì)影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病1．依據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關(guān)基因

2．用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因

（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢u（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克?。╬henotypecloning）基于對(duì)疾病表型和基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)的特征聯(lián)系已經(jīng)有所認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上來(lái)分離鑒定疾病相關(guān)基因（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克?。╬hen1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對(duì)產(chǎn)生變異的DNA片段進(jìn)行克隆，而不需要基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。

2.針對(duì)已知基因。如果高度懷疑某種疾病是由于某個(gè)特殊的已知基因所致，可通過(guò)比較患者和正常對(duì)照間該基因表達(dá)的差異來(lái)確定該基因是否為該疾病相關(guān)基因。3.針對(duì)未知基因的，可通過(guò)比較疾病和正常組織中的所有mRNA的表達(dá)種類(lèi)和含量間的差異，從而克隆疾病相關(guān)基因。這種差異可能源于基因結(jié)構(gòu)改變，也可能源于表達(dá)調(diào)控機(jī)制的改變。依據(jù)DNA或mRNA的改變與疾病表型的關(guān)系，可有幾種策略：

1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組D針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplay，mRNA-DD）抑制消減雜交（suppressivesubstractivehybridization，SSH）基因表達(dá)系列分析（SAGE）

cDNA微陣列（cDNAmicroarray）基因鑒定集成法（integratedprocedureforgeneidentification）針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdiffRDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖RDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類(lèi)的部分疾病，已經(jīng)有相應(yīng)的動(dòng)物模型。如果動(dòng)物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位,而具有相似人類(lèi)疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。另外，當(dāng)疾病基因在動(dòng)物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來(lái)定位分離人的同源基因。

（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類(lèi)的部分疾病，已經(jīng)有二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克?。╬ositionalcloning）：僅根據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關(guān)基因。定位克隆的起點(diǎn)是基因定位，即確定疾病相關(guān)基因在染色體上的位置，然后根據(jù)這一位置信息，應(yīng)用DNA標(biāo)記將經(jīng)典的遺傳學(xué)信息轉(zhuǎn)換為遺傳標(biāo)記所代表的特定基因組區(qū)域，再以相關(guān)基因組區(qū)域的相連重疊群（contig）篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差異，確定基因和疾病的關(guān)系。二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克?。╬osit（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基因2．染色體原位雜交是在細(xì)胞水平定位基因的常用方法3.染色體異常有時(shí)可提供疾病基因定位的替代方法4．連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的候選區(qū)域2．構(gòu)建目的區(qū)域的物理圖譜3.疾病相關(guān)基因的確定（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，根據(jù)患病女性X染色體與第21號(hào)常染色體的易位，以及男患兒發(fā)生小的Xp21.2缺失并伴發(fā)三種其他X連鎖隱性遺傳病，再運(yùn)用RFLP連鎖分析將DMD基因定位于Xp21。然后，分別克隆得到了基因的2個(gè)不同的片段，分別命名為XJ系列探針和pERT87系列探針，根據(jù)兩片段的比較，證明DMD基因約為2300kb，占X染色體的1%以上，該基因編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（dystrophin），影響橫紋肌和心肌的結(jié)構(gòu)和收縮功能。假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因組的關(guān)聯(lián)研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）全外顯子測(cè)序（wholeexonsequencing）三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類(lèi)基因組計(jì)劃和多種模式生物基因組測(cè)序的完成,生物信息學(xué)的發(fā)展,計(jì)算機(jī)軟件的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們通過(guò)已獲得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性比較，或?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中不同物種間的序列比較分析、拼接，預(yù)測(cè)新的全長(zhǎng)基因等，進(jìn)而通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從組織細(xì)胞中克隆該基因，這就是所謂的電子克?。╥nsilicocloning）。四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類(lèi)基因組計(jì)劃和第三節(jié)

疾病相關(guān)基因的功能研究第三節(jié)基因的功能實(shí)際是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因RNA的功能，前者是本節(jié)討論的重點(diǎn)?；虍a(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的功能可以從三個(gè)不同水平來(lái)描述：①生物化