目的基因的克隆

關(guān)于目的基因的克隆第1頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來(lái)說(shuō)，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫(kù)，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫(kù)中挑出含有目的基因的重組克?。涣硪活愂抢肞CR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。第2頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五一鳥槍法1.鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略2.鳥槍法操作的改進(jìn)3.鳥槍法克隆目的基因的局限性基因測(cè)序“鳥槍法”，也俗稱“霰彈法”。簡(jiǎn)單地說(shuō)，它有點(diǎn)類似生活中玩的拼圖游戲。拼圖游戲是將一個(gè)完整的畫面分成雜亂無(wú)章的碎塊，然后重新拼裝復(fù)原。而“鳥槍法”則是先將整個(gè)基因組打亂，切成隨機(jī)碎片，然后測(cè)定每個(gè)小片段序列，最終利用計(jì)算機(jī)對(duì)這些切片進(jìn)行排序和組裝，并確定它們?cè)诨蚪M中的正確位置?！傍B槍法”最初主要用于測(cè)定微生物基因組序列。近年來(lái)，美國(guó)塞萊拉公司先后利用改進(jìn)的全基因組“鳥槍法”完成了果蠅和人類基因組的測(cè)序工作，證明了它在測(cè)定大基因組上的可行性和有效性。“鳥槍法”優(yōu)點(diǎn)是速度快，簡(jiǎn)單易行，成本較低。

第3頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五1.鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略

隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過(guò)快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。第4頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五（1）染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端。

全酶切：片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開(kāi)，大小不可控。部分酶切：片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整。（2）與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體。如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為（3）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。（4）篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）。

第5頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五2.鳥槍法操作的改進(jìn)使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率。（1）使用特征性限制性內(nèi)切酶切開(kāi)染色體DNA

第6頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開(kāi)，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離

2.0kb1.6kb1.8kb第7頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五凍融法濾紙法吸附法低融點(diǎn)凝膠法溶解法凝膠DNA片段回收技術(shù)

第8頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA的目的。適合于從1～4mL細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至20μg高純的質(zhì)粒DNA，用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。第9頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五3.鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第10頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五二、cDNA法1.cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略2.cDNA法分離目的基因的基本程序3.cDNA法法克隆目的基因的局限性第11頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五mDNA（1）cDNA第一鏈的合成

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5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs1.cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略第12頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五（2）cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH①自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1自身環(huán)化形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)降解雙鏈中的單鏈，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)第13頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五DNApoldNTPsRNaesH②置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5‘ppp’5G

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3’3’T4-DNAligase焦磷酸鈉存在條件下合成cDNA第一鏈第14頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五dCTPTdT③引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

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3’NaOH退火KlenowdNTPs第15頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五（3）雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無(wú)法回收。

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組。分子可通過(guò)加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段。加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收。

第16頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五2.cDNA法分離目的基因的基本程序（1）完備分離程序

提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子。篩選時(shí)，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選。完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等。第17頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五（2）特異分離程序

提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆。特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等。

第18頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五（3）差異分離程序

利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因。例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能。第19頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五差異分離程序

多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞正常的FR3T3細(xì)胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價(jià)交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達(dá)的基因cDNA克隆第20頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五3.cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)。

細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短。mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感，分離純化困難。僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因。

第21頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五三PCR法

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。1.PCR法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理第22頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五由TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門aqDNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆

2.PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR擴(kuò)增產(chǎn)物T載體T7lacZMCSoriApr第23頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五四化學(xué)合成法1.化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略2.化學(xué)合成的單元操作3.DNA化學(xué)合成的用途第24頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五1.化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略（1）全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：①小片段粘接法

混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

第25頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五②補(bǔ)釘延長(zhǎng)法混合退火根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長(zhǎng)的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第26頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期五③大片段酶促法混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長(zhǎng)的單鏈DNA片段T4-DNA連接