國際上牛胚胎移植及胚胎工程

國際上牛胚胎移植及胚胎工程筆者于2002年6月20日—7月8日和2004年3月19日—4月7日分別陪同省長鈕茂生、省委書記白克明率領的河北省經(jīng)貿(mào)代表團兩次赴澳、新、韓三國訪問。

2004年4月—7月先后接待了澳大利亞SPB的總經(jīng)理劉永樹先生、法國Salers（薩來爾）牛協(xié)會主席和阿根廷胚移專家CarlosMunar（卡羅斯·莫納）到河北的來訪，就牛胚胎移植相關問題進行了交流，現(xiàn)將上述幾個國家有關牛胚胎移植應用情況歸納如下：

一、體內(nèi)胚胎生產(chǎn)（超數(shù)排卵）與胚胎移植情況（一）阿根廷莫納胚胎移植公司1．超排方法：0天放入第一個CIDR+肌注P4（50mg）+肌注BE（2mg）；第7天撤掉第1個CIDR，放入第2個CIDR+肌注P4（50mg）+肌注BE（2mg）；第11天注FSH，早，晚各1次；第12天注FSH，早，晚各1次；第13天注FSH，早，晚各1次；第14天注FSH，早，晚各1次，并且早晨撤掉第2個CIDR，早，晚各注PG1次；第15天早注FSH1次；第16天—17天發(fā)情，AI；第23—24天采胚

2．胚胎移植規(guī)模他們用上述方法每年超排牛4000—5000頭，頭均獲可用胚胎6枚左右，最高1頭獲69枚胚胎。法國Salers牛，每年胚移10000頭以上，鮮胚妊娠率70%左右。主要用于選種。

表1阿根廷莫納胚胎移植公司用體內(nèi)胚胎鮮胚移植結果受體發(fā)情天數(shù)移植頭數(shù)受胎頭數(shù)移植成功率（%）6.034221362.36.571045163.57.01502104369.47.51937134669.58.0135294169.68.534825071.8合計6191424068.5本結果為卡羅斯、莫納在墨西哥1994年移植結果。胚胎為超排7天采得的桑椹胚和早期囊胚。其中,桑椹胚移植成功率為66.6%,早期囊胚為72.09%。二、用屠宰場母牛卵巢卵母細胞體外生產(chǎn)胚胎

據(jù)新西蘭的海青蘭講，他們和新西蘭皇家農(nóng)科院合作，每周可生產(chǎn)胚胎1000枚，每年生產(chǎn)5萬枚左右。

三、澳大利亞SPB采用活體采卵（OPU）、體外受精（IVF）和胚胎移植（ET）對牛進行集中繁殖

通過使用活體采卵（超聲導向和陰道探頭（TVR））、體外受精、胚胎移植三項技術對成熟供體進行胚胎生產(chǎn)和移植。SPB采用OPU—IVF—ET對牛進行集中繁殖生產(chǎn)主要包括以下八個步驟：1、健康檢查，2、供體牛選擇，3、卵子收集，4、體外受精和胚胎生產(chǎn)，5、受體牛選擇與同情發(fā)情處理，6、胚胎的移植，7、妊娠診斷，8、接產(chǎn)與產(chǎn)犢。

SPB公司采用活體采卵每年生產(chǎn)1萬枚胚胎左右。第一步健康檢查供體母牛必須身體健康，生殖系統(tǒng)良好，先前做過MOET的母牛或具有生殖疾病的母牛被列為“劣質(zhì)?！?，因為這樣的母牛不能高效而準確地生產(chǎn)胚胎。先前做過MOET的母?？赡苡捎诓僮骰蚣に氐脑蛟斐烧尺B或卵巢囊腫、卵巢靜止等。

第二步供體牛選擇1、適宜活體采卵母牛的生理時期（1）14月齡以上發(fā)情周期正常的青年牛和成年母牛。（2）分娩后恢復發(fā)情周期的泌乳母牛，且未在產(chǎn)乳高峰期的母牛。（3）干奶期的母牛。SPB（南太平洋生物技術有限公司）認為，干奶期的母牛是最好的供體選擇。（4）人工授精后3—4周未出現(xiàn)返情的母?；驊言?個月以上的母牛。

供體牛群供體牛群第三步卵子收集1、活體采卵基本方法

（1）先將母牛麻醉，并且使母牛保持站立姿勢。（2）將超聲波探頭插入陰道，探頭會將信號傳輸?shù)綗善聊簧希瑥亩跓赡簧铣霈F(xiàn)卵巢和卵泡的形態(tài)與位置，這種陰道探頭有一個19G的細針，該細針通過硅管與真空泵相連，細針可以直接插入卵泡，將卵子吸入到收集管中。

2、活體采卵間隔時間及水平。母牛每周采卵1-2次?？砷g隔3-4天進行連續(xù)的采卵，對于正常母牛，無須進行激素刺激；但是當母牛采卵數(shù)少于7個時，可用外源激素進行適當調(diào)節(jié)。通常的做法是每14天做一次外源激素刺激；每收集一次卵子，可培養(yǎng)發(fā)育1.5-2.0個A、B級胚胎，這樣一周采集2次，可獲3.0-4.0個優(yōu)質(zhì)胚胎。

SPB每年每頭?？色@胚胎約160枚。3、影響活體采卵的因素及采卵效率。（1）對于有過生殖疾病的母?；蜃鲞^MOET的母牛，即使現(xiàn)在它們的生殖系統(tǒng)健康，不能期望高于平均值；（2）老年母牛采卵數(shù)少，并且質(zhì)量很差；（3）泌乳期的母牛，尤其在泌乳高峰期，采卵數(shù)會很低；（4）營養(yǎng)狀況十分重要，母牛處于能量與營養(yǎng)平衡時會生產(chǎn)更多、更優(yōu)的胚胎，但母牛不能過于肥胖。專門的活體采卵人員可以在6個小時采集25頭左右。

第四步體外受精與胚胎生產(chǎn)1、精液品質(zhì)鑒定：用于體外受精的精液要進行品質(zhì)鑒定。先用提前鑒定的公牛精液與從屠宰場收集的卵子進行實驗。用這種方法來判斷精液是否可以成功受精，是否可以產(chǎn)生優(yōu)良胚胎。這一步非常重要，因為人工授精良好的公牛精液不一定在體外受精時也表現(xiàn)良好。通常，一個人工授精劑量的精液可以受精200個卵子。

2、卵母細胞成熟、精子獲能、受精與早期胚胎培養(yǎng)收集的卵子檢出后放進培養(yǎng)液并送到實驗室進行體外受精，受精后需培養(yǎng)7天。受精液、培養(yǎng)液均為SPB自己配制。

3、體外受精與胚胎發(fā)育有關指標用OPU的采卵數(shù)，世界平均水平（非激素處理），每頭母?？梢砸淮尾傻?—8枚卵子。但是，即使大多數(shù)卵子都受精，也只有25%—30%的卵子發(fā)育為可供移植的胚胎，所以每頭母牛每次采卵只獲得1.5—2枚A、B胚胎。運用激素可以提高獲胚數(shù)，但是不穩(wěn)定因素也相應增加。

4、性別控制與胚胎性別鑒定（1）x、y精子分離采用流式細胞分離法2002年悉尼大學精子分離速度2萬/秒，720萬/小時，2004年SPB公司10萬/秒，3.6億/小時，24小時可分離86.4億，按每頭輸精量1000萬—1500萬計算，每天分離的精子可供864—576頭牛輸精。主要問題：一是分離速度慢，二是對精子活力有影響。適用體外受精或顯微受精。SPB目前正在研究x、y分離的新方法。即經(jīng)熒光染色的精子放入流式細胞分類器的流動小室中，然后經(jīng)小孔中流出，不讓精子帶電荷，通過紫外線激光殺死y精子，紅外激光殺死x精子，只選擇一種精子，這樣分離速度加快，方法也簡便。這種方法還在中試當中。

（2）胚胎性別鑒定SRY—PCR鑒定法：

借助顯微操作儀從桑椹胚或囊胚中分離幾個細胞，提取DNA，用PCR擴增后，根據(jù)熒光（亮）的為公，暗的為母。

5、胚胎冷凍與移植效果所獲胚胎用澳大利亞產(chǎn)冷凍儀進行常規(guī)冷凍。OPU和IVF胚胎進行冷凍，解凍后A級胚胎有40%在移植后產(chǎn)犢，B級胚胎為30%—35%，性別鑒定的胚胎只能達到30%左右。

第五步受體牛的選擇與同期發(fā)情處理1．受體牛選擇

（1）不能帶有傳染性的疾病

（2）超聲波檢查生殖器官：受體通過超聲波檢查來發(fā)現(xiàn)繁殖系統(tǒng)疾?。ㄈ缱訉m感染、卵巢囊腫），同時檢查其是否懷孕。（3）口、蹄、乳房和乳頭檢查：要徹底檢查受體的口（確定年齡和牙齒狀況）、蹄、乳房和乳頭，有乳房炎以及蹄病的年老受體不能使用。

（4）身體結構良好，母性能力強，適合當?shù)貧夂驐l件。在受體選擇過程中，其身體結構和性情也是十分重要的：骨盆面積和寬度，蹄形，乳房與乳頭結構，母性能力與產(chǎn)奶量是重要方面。在任何情況下，受體應該選用適合當?shù)貧夂虻葪l件的品種。

（5）適宜作受體的年齡（胎次）：理想的受體是斷奶的初胎母牛（后代健康）。如果是奶牛的話，最好是分娩后體重已經(jīng)開始回升的奶牛。用青年牛作受體時，它們一般對同期發(fā)情處理敏感，并且移植妊娠率較高，但是難產(chǎn)率高。

（6）受體慎用疫苗和藥物

受體在處理的15天前至妊娠6周不能接種疫苗或藥物治療。否則影響受胎和胎兒發(fā)育。

2．受體牛同期發(fā)情除傳統(tǒng)的PG法和孕激素方法外，目前采用復合激素法為多，主要有以下兩種方法。第一種：0天，從陰道放入CIDR，肌注P450mg，肌注BE2mg。第7天撤除CIDR并注PG，第8天再注BE2mg，第9天發(fā)情。

第二種：0天，從陰道放入第1個CIDR，第10天撤出第1個CIDR,放入第2個CIDR，第16天肌注PMSG，第18天撤出第2個CIDR并肌注PG，第19-20天發(fā)情。

3．受體發(fā)情觀察、標記與記錄

第六步胚胎的移植1．胚齡（胚胎發(fā)育階段）與受體發(fā)情時間同步

因為體外生產(chǎn)的胚胎的耐受性較MOET胚胎差，因此受體應該在第7天或第7.5天進行移植，對于孵化囊胚，受體應該在第8天進行移植。受體牛要在進行IVF的當天發(fā)情或進行IVF的前一天發(fā)情（采卵當天發(fā)情）。通常，對于無激素刺激而收集卵子的母牛，一個供體要準備2.5頭受體；激素刺激而收集卵子的母牛，一個供體要準備3.5頭受體。這樣，根據(jù)黃體數(shù)量與質(zhì)量來選擇受體。

2、胚胎的移植體外受精7天后開始移植（通常是采卵后8天），體外生產(chǎn)的鮮胚有50%的成功率，冷凍胚胎有40%的成功率，性別鑒定后而移植的鮮胚與非性別鑒定的胚胎有相似的成活率。

OPU—IVF—ET技術按如下順序進行：第-1天：活體采卵。第0天：體外受精。第1天：體外胚胎培養(yǎng)。第5天：后期培養(yǎng)條件的改變以及胚胎受精、發(fā)育的鑒定。第7天：第1次胚胎發(fā)育的最終鑒定，發(fā)育較快的胚胎可以移植或冷凍。第8天：第2次胚胎發(fā)育的最終鑒定：可以進行移植或冷凍。胚胎性別鑒定可以在第7天或第8天進行，然后移植鮮胚。

第七步超聲波檢測妊娠情況胚胎移植后15—18天，受體母牛如果不出現(xiàn)發(fā)情現(xiàn)象，可認為它們已經(jīng)有可能懷孕。但是也有假妊娠的母牛。通過超聲波技術可以控制妊娠情況，可以檢測出發(fā)育35