氟烷基因檢測(cè)

商品豬的氟烷基因型研究摘要：為了了解市場(chǎng)上商品豬豬肉的質(zhì)量情況，本實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合限制酶內(nèi)切技術(shù)（PCR-RFLP）研究商品豬的氟烷基因型。結(jié)果表明：在我們?nèi)〉?個(gè)樣品豬中，有一頭商品豬的DNA為雜合子，即雙鏈DNA中有一條DNA發(fā)生了基因突變，患有豬的應(yīng)激敏感綜合征。關(guān)鍵詞：氟烷基因；PCR擴(kuò)增；聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合限制性內(nèi)切酶技術(shù)；凝膠電泳單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorpgism，SNP），指的是由單個(gè)核苷酸—A，T，C或G的改變而引起的DNA序列的改變，這種變異可能會(huì)引起性狀的改變或者導(dǎo)致疾病的發(fā)生。如豬的蘭尼定受體(Rynodinereceptor,RYR1)基因CDS序列第1843位堿基“C”突變?yōu)椤癟”，使蛋白第615位精氨酸(Arg,CGC)變成了半胱氨酸(Cys,TGC)，引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變，這種改變能夠引起豬的應(yīng)激敏感綜合征。豬應(yīng)激綜合增是指豬在應(yīng)激因子（如驅(qū)趕、運(yùn)輸、防疫注射、配種、受驚嚇等）等的應(yīng)激下，發(fā)生惡性、高熱綜合征，表現(xiàn)為呼吸急促，心跳加快，肌肉僵直，后肢呈現(xiàn)痙攣性收縮等，甚至突然死亡。而對(duì)商品豬而言，會(huì)導(dǎo)致豬肉質(zhì)量嚴(yán)重下降，如肌肉蒼白、質(zhì)地疏松和有液體滲出等，大大降低了豬肉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，TT基因型的陽(yáng)性純合子個(gè)體已經(jīng)在大多數(shù)種豬育種場(chǎng)得到了凈化，為合理制定育種規(guī)劃、減少后代陽(yáng)性頻率提供科學(xué)依據(jù)。那么TT基因型個(gè)體是如何得到凈化的？PCR-RFLP則目前檢測(cè)豬氟烷基因變異及進(jìn)行基因分型最常用的方法。試驗(yàn)材料豬耳組織DNA。實(shí)驗(yàn)方法2.1豬基因組DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)2.1.1豬基因組DNA的提取稱取200mg的豬耳組織樣，剪碎，置于1.5ml的離心管中。向離心管中加入裂解液650ul，蛋白酶k25ul，混勻，置于50℃恒溫孵育14-20h，直至看不到組織塊。取出離心管加入Tris飽和酚400ul、氯仿384ul和異戊醇16ul，室溫震蕩10-15min，置于轉(zhuǎn)速1200g的離心機(jī)中離心10min。將離心管的上清液置于另一個(gè)潔凈1.5ml離心管中，加入700ul異戊醇使之沉淀（與上清液體積相當(dāng)），輕輕晃動(dòng)，直至白色絮狀DNA出現(xiàn)，然后置于轉(zhuǎn)速為12000g的離心機(jī)中離心10min。棄去上清液，留沉淀，用75%乙醇漂洗，再離心（12000g2.1.2Ⅰ2%瓊脂糖凝膠的配制用天平稱取0.5g瓊脂糖，倒入250mL的錐形瓶中，加入50mL的1×TAE溶液，均勻混合后，微波爐加熱2min，使瓊脂糖充分溶解，小心取出（防止?fàn)C傷），等溫度降至50-60℃時(shí)，加入1-2μⅡ凝膠電泳將凝膠取出，放在水平電泳槽中，倒入1×TBE溶液，將凝膠完全浸沒(méi)。然后取3μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，并與3μL上樣緩沖液混勻，將其點(diǎn)入梳孔中；同時(shí)在其中一梳孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，以備。接通電泳儀電源，80V電泳15min，最后關(guān)閉電源，紫外燈下或者凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察或拍照。2.2豬HAL基因的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)2.2.1PⅠPCR反應(yīng)體系的配制按照如下比例配制，反應(yīng)體積為20μL（也可以根據(jù)實(shí)際情況確定相應(yīng)的體積）。各成分的初始濃度和用量如下（表1）：表1PCR反應(yīng)體系（20μL）成分最初溶度或者含量體積(μL)5×Buffer（含Mg2+）5×4dNTPs1.6TaqDNA聚合酶0.2上游引物10nM/mL0.4下游引物10nM/mL0.4DNA模板50ng/μL0.4ddH2O13總體積20在配制上述溶液時(shí)，一般將除了DNA模板外的所有成分混合，均勻分裝到滅菌的用于PCR擴(kuò)增的Ep管中（0.2mL規(guī)格）。在分裝好的Ep管中加入DNA模板，蓋緊蓋子，瞬時(shí)離心，使各成分混合均勻。ⅡPCR反應(yīng)程序首先95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后設(shè)置PCR反應(yīng)程序時(shí)，主要是退火溫度和延伸時(shí)間的設(shè)置，退火溫度的設(shè)置是根據(jù)引物的性質(zhì)進(jìn)行，而延伸時(shí)間是根據(jù)擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度設(shè)置，1kb的延伸時(shí)間一般設(shè)定1min。2.2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（同上）2.3豬HAL基因的突變檢測(cè)（RFLP）（酶切-瓊脂糖凝膠電泳）經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，PCR產(chǎn)物可以直接用于RFLP檢測(cè)。按HhaI內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū)要求，取10uLPCR產(chǎn)物，10×Buffer2uL，0.5uLHhaI內(nèi)切酶(10U/uL)，加水至20uL，37℃溫育3h，3％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并拍照。結(jié)果與分析3.1豬基因組DNA提取及瓊脂凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果分析8個(gè)DNA樣品經(jīng)過(guò)染色、瓊脂糖凝膠電泳后得到圖16條橘色條帶，且顏色比較亮，說(shuō)明我們提取到了豬基因組DNA并成功染上顏色。但其中有兩個(gè)樣品的DNA沒(méi)有顯示出橘色條帶，說(shuō)明沒(méi)有提取到豬基因組DNA，其原因可能是我們?cè)谔幚碡i耳組織塊時(shí)，沒(méi)有剪碎，裂解不夠徹底，提取量不夠，導(dǎo)致無(wú)法支持后面實(shí)驗(yàn)的耗損。圖1豬基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果3.2豬HAL基因的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果分析7個(gè)樣品DNA模板經(jīng)PCR擴(kuò)增，均得到長(zhǎng)度在750bp到500bp間，大約為660bp的DNA產(chǎn)物片段（如圖A和B）。圖2PCR擴(kuò)增氟烷基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果ABAB注：DNAMarker大小（即序號(hào)8）：從上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp3.3豬HAL基因的突變檢測(cè)（RFLP）（酶切-瓊脂糖凝膠電泳）根據(jù)圖3C可知，擴(kuò)增后的豬基因DNA，再經(jīng)過(guò)Hhall限制性內(nèi)切酶切后，以1為對(duì)照，2-6的基因型（基因長(zhǎng)度）分別為：CC（495bp+165bp）、CC（495bp+165bp）、CC（495bp+165bp）、--、CC（495bp+165bp）,沒(méi)有出現(xiàn)突變型基因。根據(jù)圖3D可知，擴(kuò)增后的豬基因DNA，再經(jīng)過(guò)Hhall限制性內(nèi)切酶切后，以1為對(duì)照，2-7的基因型（基因長(zhǎng)度）分別為：--、--、CC（495bp+165bp）、--、--、TC（660bp+495bp+165bp），沒(méi)有出現(xiàn)TT基因型突變。豬氟烷基因型的檢測(cè)是通過(guò)PCR獲得豬HAL基因包含CDS序列第1843位堿基突變點(diǎn)的DNA片段。當(dāng)HAL基因未發(fā)生突變，即陰性純合子（CC型），其GCGC序列就會(huì)被HhaI限制性內(nèi)切酶（酶切DNA序列是：5’GCG↓C3’）識(shí)別，從而將660bp的片段切割成495bp+165bp的兩段條帶。當(dāng)兩條染色體中的一條其C堿基突變?yōu)門(mén)時(shí)，即雜合子（TC），該鏈的酶切位點(diǎn)消失，變成變成5’GTGC3’，不能被HhalI切割，其長(zhǎng)度依舊為660bp；另一條鏈正常，被HhalI切割為495bp+165bp，所以出現(xiàn)三條帶鏈。而當(dāng)兩條染色體的C堿基完全突變?yōu)門(mén)時(shí)，即陽(yáng)性純合子（TT），酶切位點(diǎn)消失，變成5’圖3氟烷基因Hhal酶切瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果654321C654321C7654321D7654321D討論在進(jìn)行豬HAL基因的突變檢測(cè)（RFLP）（酶切-瓊脂糖凝膠電泳）時(shí)，電泳結(jié)果有些條帶很不清楚，甚至沒(méi)有顯現(xiàn)出現(xiàn)，其原因可能是多方面的，主要原因可能是提取量不足而損耗嚴(yán)重；離心機(jī)轉(zhuǎn)速不夠DNA離取不徹底；電泳時(shí)間不夠等。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本符合現(xiàn)實(shí)。在現(xiàn)實(shí)生活中豬氟烷基因突變率是比較低的，基因型TT的豬仔早已被淘汰，幾乎不可能流入市場(chǎng)，只有少數(shù)突變體TC的雜合體，絕大多數(shù)為CC型正常豬仔。隨著多元雜交瘦肉型豬的推廣，為追求高的飼料報(bào)酬，人們大都采用封閉式圈養(yǎng)，喂以高蛋白能量的全價(jià)飼料，這對(duì)促進(jìn)豬的生長(zhǎng)，提高瘦肉率和經(jīng)濟(jì)效益是有利的。但是高瘦肉率和屠宰率的豬對(duì)應(yīng)激刺激反應(yīng)強(qiáng)烈，引起豬應(yīng)激敏感綜合征。而引起該癥狀的基因便是豬氟烷基因（Haln）。據(jù)帥素容等（2002）研究表明：豬氟烷基因具有提高酮體產(chǎn)肉量的作用，這但在肉質(zhì)形狀上，具有降低肉色、提高肌肉失水率和產(chǎn)生PSE肉的效應(yīng)（董佩佩，劉志軍，2010），而肉味差、口感粗硬、品質(zhì)不佳的PSE肉有悖于人們對(duì)肉質(zhì)要求越來(lái)越高的愿望，也因此影響了上市豬肉銷售質(zhì)量，同時(shí)據(jù)鞠慧萍等（2006）人的研究表明：氟烷敏感基因課導(dǎo)致總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔數(shù)下降，初生窩重和個(gè)體斷奶重降低，并使生長(zhǎng)速度減慢，即氟烷基因?qū)Ψ敝承阅苡休^顯著的不良影響。我國(guó)地方豬種攜帶氟烷基因很少。但是，自80年代以來(lái)，從國(guó)外大量引進(jìn)瘦肉型豬種，很有可能將攜帶此有害隱性基因的純合體和雜合體引入國(guó)內(nèi)，流傳擴(kuò)散。對(duì)此我們可以通過(guò)以下幾點(diǎn)進(jìn)行預(yù)防：1、從國(guó)外進(jìn)口種豬時(shí)，除進(jìn)行常見(jiàn)的傳染病檢驗(yàn)，要把豬應(yīng)激綜合癥列為豬的首檢遺傳病，嚴(yán)格氟烷檢驗(yàn)。引入后要進(jìn)行2～3世代的連續(xù)檢驗(yàn)，以防氟烷基因擴(kuò)散。2、有組織地對(duì)飼養(yǎng)外來(lái)品種的大型集約化豬場(chǎng)進(jìn)行氟烷基因普查。3、在組織豬育種或雜交生產(chǎn)時(shí)，要慎重選擇外來(lái)品種。研究表明，不同品種豬的PSS易感性不同。比系蘭德瑞斯發(fā)生率較高（53%~85%），皮特蘭最高（35%~100%），屬?gòu)?qiáng)應(yīng)激敏感系。漢普夏和大多數(shù)蘭德瑞斯品系居中，杜洛克、大白豬屬?gòu)?qiáng)抗應(yīng)激系（趙秀娟，帥素容，2002）。參考文獻(xiàn)[1]步宏,劉戟,李勝富,程驚秋等.中國(guó)近交系豬的氟烷基因型研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志.2000（05）[2]帥素容,羅安治,程支中,郭雁君,巨新義.氟烷基因與豬經(jīng)濟(jì)形狀的相關(guān)研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2002（03）[3]董佩佩,劉志軍,賈俊靜,高士爭(zhēng),張曦.影響豬肉品質(zhì)的基因及研