核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件

第八章克隆動(dòng)物第八章克隆動(dòng)物克隆羊多利（Dolly）的誕生1997年2月，英國(guó)Roslin研究所宣布克隆羊多利（Dolly）的誕生揭示一個(gè)全新概念：由成年機(jī)體的一個(gè)體細(xì)胞核，可以復(fù)制一個(gè)基因完全相同的新生命個(gè)體。是克隆技術(shù)的里程碑。克隆一詞變得家喻戶曉克隆羊多利（Dolly）的誕生1997年2月，英國(guó)Rosli克隆來(lái)源于英語(yǔ)“clone”或“cloning”的音譯，起源于希臘文“Klone”，原意是用“插條”繁殖。曾譯為無(wú)性生殖或無(wú)性繁殖.克隆在分子、細(xì)胞、個(gè)體三個(gè)水平上克隆來(lái)源于英語(yǔ)“clone”或“cloning”的音譯，起源動(dòng)物克隆動(dòng)物克隆是指通過(guò)無(wú)性繁殖的手段，從一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞獲得遺傳背景相同的個(gè)體群的過(guò)程。獲得的個(gè)體群稱為克隆動(dòng)物（clonedanimal）動(dòng)物克隆動(dòng)物克隆是指通過(guò)無(wú)性繁殖的手段，從一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞獲得遺動(dòng)物克隆的研究歷史1、最初用胚胎分割的方法獲得克隆動(dòng)物。2、同卵雙生或孤雌生殖的方式獲得克隆動(dòng)物。3、通過(guò)核移植獲得克隆動(dòng)物，但開(kāi)始僅限于胚胎細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的克隆。4、1997年，克隆羊多莉的誕生，標(biāo)志著體細(xì)胞克隆的成功。5、現(xiàn)有多種體細(xì)胞克隆動(dòng)物誕生，如牛、豬、老鼠、貓、羊、兔、貓、狗等。動(dòng)物克隆的研究歷史1、最初用胚胎分割的方法獲得克隆動(dòng)物。1998年1月，美國(guó)威斯康星一麥迪遜大學(xué)的科學(xué)家們以牛的卵子為受體，成功克隆出豬、牛、羊、鼠和獼猴五種哺乳動(dòng)物的胚胎，這一研究結(jié)果表明，某個(gè)物種的未受精卵可以同取自多種動(dòng)物的成熟細(xì)胞核相結(jié)合。1999年，美國(guó)科學(xué)家用牛卵子克隆出珍稀動(dòng)物盤(pán)羊的胚胎；我國(guó)科學(xué)家也用兔卵子克隆了大熊貓的早期胚胎，在異種克隆研究領(lǐng)域，目前國(guó)際上僅有印度野牛和歐洲盤(pán)羊取得成功。到目前為止應(yīng)用異種核移植技術(shù)獲得的活體后代都來(lái)自于亞種間核移植。中國(guó)首例異體克隆動(dòng)物———瀕危動(dòng)物北山羊在新疆烏魯木齊縣六十戶鄉(xiāng)降生1998年1月，美國(guó)威斯康星一麥迪遜大學(xué)的科學(xué)家們以牛的卵子核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件獲得克隆動(dòng)物的方法1.胚胎分割2.孤雌生殖3.細(xì)胞核移植獲得克隆動(dòng)物的方法1.胚胎分割1.胚胎分割胚胎分割（embryosplitting）是指采用機(jī)械方法用特制的纖維刀片或玻璃微針將早期胚胎分割成2等分、4等分或多等分，再移植給受體母畜，從而獲得同卵多仔的一項(xiàng)胚胎工程技術(shù)。1.胚胎分割胚胎分割（embryosplitting）是指核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件胚胎分割——

一卵雙生

胚胎分割——一卵雙生

胚胎分割——

一卵雙生

胚胎分割——一卵雙生2.孤雌生殖孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵子不經(jīng)受精，直接發(fā)育為個(gè)體的繁殖方式。如：蚜蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)2.孤雌生殖孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵（一）偶發(fā)性孤雌生殖(sporadicparthenogenesis)：偶發(fā)性孤雌生殖是指某些昆蟲(chóng)在正常情況下行兩性生殖，但雌成蟲(chóng)偶爾產(chǎn)出的未受精卵也能發(fā)育成新個(gè)體的現(xiàn)象。常見(jiàn)的如家蠶、一些毒蛾和枯葉蛾等。

（二）經(jīng)常性孤雌生殖(constantparthenogenesis)：經(jīng)常性孤雌生殖也稱永久性孤雌生殖。這種生殖方式在某些昆蟲(chóng)中經(jīng)常出現(xiàn)，而被視為正常的生殖現(xiàn)象。可分為兩種情況：

1、在膜翅目的蜜蜂和小蜂總科的-些種類(lèi)中，雌成蟲(chóng)產(chǎn)下的卵有受精卵和未受精卵兩種，前者發(fā)育成雌蟲(chóng)，后者發(fā)育成雄蟲(chóng)。

2、有的昆蟲(chóng)在自然情況下，雄蟲(chóng)極少，甚至尚未發(fā)現(xiàn)雄蟲(chóng)，幾乎或完全行孤雌生殖，如一些竹節(jié)蟲(chóng)、粉虱、蚧、薊馬等。

（一）偶發(fā)性孤雌生殖(sporadicparthenog（三）周期性孤雌生殖(cyclicalparthenogenesis)：周期性孤雌生殖也稱循環(huán)性孤雌生殖。昆蟲(chóng)通常在進(jìn)行1次或多次孤雌生殖后，再進(jìn)行1次兩性生殖。這種以兩性生殖與孤雌生殖交替的方式繁殖后代的現(xiàn)象，又稱為異態(tài)交替(heterogeny)或世代交替(alternationofgenerations)。如棉蚜從春季到秋末，行孤雌生殖10一20余代，到秋末冬初則出現(xiàn)雌、雄兩性個(gè)體，并交配產(chǎn)卵越冬。（三）周期性孤雌生殖(cyclicalpartheno蜥蜴蜥蜴蚜蟲(chóng)蚜蟲(chóng)

問(wèn)題在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生了分化，但是在適宜環(huán)境下，已分化的細(xì)胞能否重新恢復(fù)到發(fā)育的起始狀態(tài)，再重新發(fā)育成其它類(lèi)型細(xì)胞組織的多能性，甚至發(fā)育成完整個(gè)體的全能性呢？細(xì)胞的分化是不是發(fā)生了不可逆的變化？問(wèn)題在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生HANSSPEMANN

1935NobelLaureateinMedicine

forhisdiscoveryoftheorganizereffectinembryonicdevelopment.

1869-1941

Residence:Germany

Affiliation:UniversityofFreiburgimBreisgau

德國(guó)胚胎學(xué)家Spemann提出通過(guò)核移植可以驗(yàn)證不同發(fā)育階段和不同分化程度的細(xì)胞核是否具有全能性。HANSSPEMANN

3.細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植（nucleartransfer）是指將早期胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞或成體動(dòng)物的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，重新組成重構(gòu)胚（reconstructedembryo）或克隆胚（clonedembryo）并使之發(fā)育成成體動(dòng)物的過(guò)程。

3.細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植（nucleartrans提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核供體（donor）接受細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核受體（recipient）核供體：胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、體細(xì)胞（somaticcell）核受體：早期胚胎細(xì)胞、受精卵、MII期卵母細(xì)胞提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核供體（donor）核供體：胚胎減數(shù)分裂分裂期：減數(shù)分裂期Ⅰ：前期Ⅰ、前中期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ和胞質(zhì)分裂期Ⅰ等6個(gè)階段。減數(shù)分裂期Ⅱ：前期Ⅱ、前中期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末期Ⅱ和胞質(zhì)分裂期Ⅱ等6個(gè)階段。前期Ⅰ：細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期5個(gè)階段。減數(shù)分裂分裂期：核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件供體細(xì)胞的細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞后，在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下，發(fā)生了重編程回復(fù)到發(fā)育的起點(diǎn)狀態(tài)。核重編程的過(guò)程就是使在體細(xì)胞中被關(guān)閉,而在正常胚胎發(fā)育中表達(dá)的基因重新被激活的過(guò)程.核移植的機(jī)理供體細(xì)胞的細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞后，在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下，重編程有三種可能的結(jié)果（1）供核基因組完全沒(méi)有進(jìn)行重編程重構(gòu)胚很快死亡；（2）部分重編程,重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡；

（3）完全重編程,產(chǎn)生正常的克隆動(dòng)物。重編程有三種可能的結(jié)果（1）供核基因組完全沒(méi)有進(jìn)行重編程細(xì)胞核移植分類(lèi)根據(jù)核供體細(xì)胞來(lái)源的不同

1.胚胎細(xì)胞核移植

2.胎兒細(xì)胞核移植

3.體細(xì)胞核移植（SCNT）根據(jù)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞是否來(lái)源于同一種動(dòng)物又可將其分為

1.同種核移植2.異種核移植細(xì)胞核移植分類(lèi)根據(jù)核供體細(xì)胞來(lái)源的不同顯微操作儀（micromanipulator）顯微操作儀（micromanipulator）胚胎細(xì)胞核移植

胚胎細(xì)胞核移植(embryocelluncleartransplantation)是指，將一個(gè)早期胚胎的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。胚胎細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞核移植(embryocell胚胎細(xì)胞核移植流程圖胚胎細(xì)胞核移植流程圖歷史回顧1938年Spemann提出設(shè)想：分化了的細(xì)胞核移植能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育？1952年Briggs和King在兩棲動(dòng)物證實(shí)了Spemann提出的設(shè)想：利用已分化的蛙囊胚細(xì)胞核移植到去核的蛙卵母細(xì)胞中，得到了重新發(fā)育的結(jié)果，從而證明了不同時(shí)期的胚胎細(xì)胞核在相同的卵質(zhì)中具有重新發(fā)育的能力，在特定條件下，可以恢復(fù)其發(fā)育的全能性。歷史回顧1938年Spemann提出設(shè)想：分化了的細(xì)胞核移植1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾門(mén)澤、美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，首次對(duì)小鼠胚胎細(xì)胞進(jìn)行核移植獲得成功。此后，胚胎細(xì)胞的核移植在多種動(dòng)物上獲得了克隆后代，如綿羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。直到1997年才由Mengetal成功地克隆出兩只猴,這是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的首次被克隆。1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾門(mén)澤、美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，首次

直至此時(shí),核移植所用的供體細(xì)胞均為囊胚階段以前的胚胎細(xì)胞。當(dāng)時(shí)人們普遍認(rèn)為，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后則隨著分化而逐漸喪失其全能性。直至此時(shí),核移植所用的供體細(xì)胞均為囊胚階段以前的胚胎細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞群2.雌原核與雄原核融合3.卵裂開(kāi)始4.2細(xì)胞期極體透明帶極體卵裂球受精卵原核卵周腔5.4細(xì)胞期6.8細(xì)胞期滋養(yǎng)層7.桑椹胚胚泡腔8.囊胚1.雌原核與雄原核形成

內(nèi)細(xì)胞群2.雌原核與雄原核融合3.卵裂開(kāi)始4.2細(xì)胞體細(xì)胞核移植技術(shù)動(dòng)物克隆技術(shù)的里程碑體細(xì)胞核移植技術(shù)動(dòng)物克隆技術(shù)的里程碑

體細(xì)胞核移植技術(shù)(somaticcelluncleartransplantation)是指，將分化程度較高的體細(xì)胞移植入去核的卵母細(xì)胞中構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。體細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植技術(shù)(somaticcellunclea歷史回顧1996年，世界第一例從成年動(dòng)物細(xì)胞克隆出的哺乳動(dòng)物綿羊多莉誕生。這個(gè)秘密直到1997年2月才向世人公布。1997年7月，蘇格蘭科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將一個(gè)人類(lèi)基因?qū)刖d羊體細(xì)胞，克隆了帶有人類(lèi)基因的綿羊“波莉”。歷史回顧1996年，世界第一例從成年動(dòng)物細(xì)胞克隆出的哺乳動(dòng)物1998年7月，美國(guó)夏威夷大學(xué)Wakayama等報(bào)道，由小鼠卵丘細(xì)胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多莉”以后的第二批哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植后代。此后，體細(xì)胞核移植技術(shù)在牛、山羊、豬等多種動(dòng)物獲得成功。至1999年底，全世界已有6種類(lèi)型細(xì)胞——胎兒成纖維細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、輸卵管／子宮上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和耳部皮膚細(xì)胞的體細(xì)胞克隆后代成功誕生。1998年7月，美國(guó)夏威夷大學(xué)Wakayama等報(bào)道，由小多莉的誕生過(guò)程多莉的誕生過(guò)程核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件體細(xì)胞核移植程序核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備重構(gòu)胚的激活重構(gòu)胚的培養(yǎng)移植給代孕動(dòng)物去核卵母細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控后的體細(xì)胞融合后形成重構(gòu)胚裝核體細(xì)胞核移植程序核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備重構(gòu)胚的激核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件1.核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備常用的體細(xì)胞有：卵丘細(xì)胞顆粒細(xì)胞皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞在體外一般在體外傳代8-16次1.核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備常用的體細(xì)胞有：A

組織塊培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞

B消化培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞

A組織塊培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞B消化培養(yǎng)的人皮膚2.細(xì)胞周期的調(diào)控1.血清饑餓法2.Aphidicolin（阿菲迪霉素）法3.激活卵母細(xì)胞法2.細(xì)胞周期的調(diào)控1.血清饑餓法核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件3.受體細(xì)胞準(zhǔn)備目前為止，有三類(lèi)用于核移植產(chǎn)生了后代第一類(lèi)是去除原核的受精卵第二類(lèi)是早期胚胎；第三類(lèi)即是MⅡ期的卵母細(xì)胞。常用的是MⅡ期的卵母細(xì)胞，一般通過(guò)超數(shù)排卵和體外成熟培養(yǎng)獲得3.受體細(xì)胞準(zhǔn)備目前為止，有三類(lèi)用于核移植產(chǎn)生了后代4.去核的方法1.盲吸法2.半卵法3.熒光引導(dǎo)核法4.微分干涉顯微鏡去核法5.功能性去核法6.離心去核法7.末期去核法4.去核的方法1.盲吸法盲吸去核法一般將脫去顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞用含7.5ug/mlCB的培養(yǎng)液中清洗3-4遍后移入100ul左右的上述溶液的液滴中，同時(shí)將供體細(xì)胞加入液滴中。石蠟油覆蓋后于顯微操作儀上用固定針吸住卵母細(xì)胞，用去核針撥動(dòng)之，使第一極體位于1點(diǎn)位置；去核針從3點(diǎn)處進(jìn)針，針尖斜面部分刺入卵泡內(nèi)，吸出第一極體及其下方的1/4-1/3胞質(zhì)（包括細(xì)胞核）；然后從操作液中吸取形態(tài)圓，邊緣略粗糙的核供體細(xì)胞，從原針吸口處注入透明帶下并輕壓透明帶。去核舉例去核舉例MII期卵母細(xì)胞MII期卵母細(xì)胞去核過(guò)程去核過(guò)程5.裝核將準(zhǔn)備好的體細(xì)胞放入去核卵母細(xì)胞的過(guò)程。將體細(xì)胞放入帶下5.裝核將準(zhǔn)備好的體細(xì)胞放入去核卵母細(xì)胞的過(guò)程。將體細(xì)胞放入ABCDEFA顯微注射針刺入卵母細(xì)胞前B開(kāi)始吸取第一極體C極體已被吸入注射針D去除極體后的卵母細(xì)胞E注射供體細(xì)胞F供體細(xì)胞已被注入透明帶下ABCDEFA顯微注射針刺入卵母細(xì)胞前B開(kāi)始吸取第一直接注射法直接注射法6.細(xì)胞融合

細(xì)胞融合的方法有：病毒介導(dǎo)融合化學(xué)融合電融合6.細(xì)胞融合細(xì)胞融合的方法有：利用電穿孔的原理來(lái)使細(xì)胞融合。為使供/受體細(xì)胞的接觸面與電場(chǎng)方向垂直,更有利于融合,可在待融的供/受體復(fù)合物移入兩微電極絲所組成的融合小槽內(nèi)后用一次交流脈沖或手工排步的方式來(lái)達(dá)到這一目的。電融合舉例利用電穿孔的原理來(lái)使細(xì)胞融合。為使供/受體細(xì)胞的卵母細(xì)胞與體細(xì)胞電融合過(guò)程卵母細(xì)胞與體細(xì)胞電融合過(guò)程7.重構(gòu)卵激活正常情況下,受精過(guò)程中，精子進(jìn)入卵子后,卵母細(xì)胞質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)一系列的反應(yīng),如游離Ca2+濃度增高、母源性的mRNA啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、MPF等因子活性下降等。這些反應(yīng)是卵母細(xì)胞被激活的標(biāo)志，不經(jīng)過(guò)這些變化,胚胎就不能正常發(fā)育。核移植過(guò)程中的激活就是模仿受精過(guò)程中精子的刺激作用。目前，激活的方式有電激活、化學(xué)激活和注射精子因子激活三種。化學(xué)激活常用藥品有：鈣離子載體（A23187）、7%乙醇、離子霉素、6-DMAPSrCl27.重構(gòu)卵激活正常情況下,受精過(guò)程中，精子進(jìn)入卵子后,卵母細(xì)8.重構(gòu)胚的培養(yǎng)重構(gòu)胚移入受體之前的培養(yǎng)方法有體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)兩種方法。體外培養(yǎng)法相對(duì)要簡(jiǎn)單、方便的多。目前為大部分核移植所采用。8.重構(gòu)胚的培養(yǎng)重構(gòu)胚移入受體之前的培養(yǎng)方法有體外培養(yǎng)和體重構(gòu)胚體外發(fā)育圖重構(gòu)胚體外發(fā)育圖人類(lèi)體細(xì)胞核移植技術(shù)人類(lèi)體細(xì)胞核移植技術(shù)歷史回顧2001年，美、意科學(xué)家聯(lián)手展開(kāi)克隆人的工作。2001年11月美科學(xué)家宣布首次克隆成功了處于早期階段的人類(lèi)胚胎，稱其目的是為病人“定制”出不會(huì)誘發(fā)排異反應(yīng)的人體組織器官，用于移植。2004年2月11日，美國(guó)《科學(xué)》雜志宣布，漢城國(guó)立大學(xué)研究小組成功克隆出人類(lèi)早期胚胎，并從中提取出胚胎干細(xì)胞。由于法律的限制，人的克隆僅限于治療性克隆。歷史回顧2001年，美、意科學(xué)家聯(lián)手展開(kāi)克隆人的工作。治療性克隆技術(shù)途徑包括以下幾個(gè)步驟：首先取病人體細(xì)胞核，移植到去核的成熟受體卵母細(xì)胞；在早期胚胎形成后，從中分離獲得人ES細(xì)胞；對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行基因修飾和定向分化研究；將定向分化后的細(xì)胞移植給病人。治療性克隆技術(shù)途徑包括以下幾個(gè)步驟：治療性克隆流程圖治療性克隆流程圖生殖性克隆流程圖生殖性克隆流程圖人類(lèi)體細(xì)胞核移植存在的問(wèn)題在人類(lèi)，由于倫理等原因，卵母細(xì)胞的獲得比較困難，這就給體細(xì)胞核移植技術(shù)在人類(lèi)醫(yī)療方面的應(yīng)用帶來(lái)很大的限制，限制了核移植技術(shù)為人類(lèi)服務(wù)的初衷。人類(lèi)體細(xì)胞核移植存在的問(wèn)題在人類(lèi)，由于倫理等原因，卵母細(xì)胞的解決辦法異種核移植解決辦法異種核移植異種核移植將人的體細(xì)胞作為核供體，另一種動(dòng)物的卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞而進(jìn)行的核移植技術(shù)。

人體細(xì)胞動(dòng)物卵母細(xì)胞去核異種克隆胚異種核移植將人的體細(xì)胞作為核供體，另一種動(dòng)物的卵母細(xì)胞上海第二醫(yī)科大學(xué)陳瑩博士

2003年，她將一5歲男孩的包皮細(xì)胞與已去除細(xì)胞核的新西蘭兔卵母細(xì)胞融合，獲得了人類(lèi)早期胚胎。上海第二醫(yī)科大學(xué)2003年，她將一5歲男孩的包皮細(xì)胞與已去人兔異種核移植的焦點(diǎn)問(wèn)題1.非人類(lèi)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞可否對(duì)人體細(xì)胞核進(jìn)行重編程？人兔異種核移植的焦點(diǎn)問(wèn)題1.哺乳動(dòng)物核移植中,無(wú)論采用電融合法還是胞質(zhì)內(nèi)注射法構(gòu)建重構(gòu)卵,都不可避免地會(huì)把部分供體線粒體帶入受體卵胞質(zhì)。兩種來(lái)源的線粒體在重構(gòu)胚的各階段發(fā)育中到底會(huì)有什么樣的變化一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。2.核移植中線粒體的命運(yùn)哺乳動(dòng)物核移植中,無(wú)論采用電融合法還是胞質(zhì)內(nèi)注射法構(gòu)建重構(gòu)卵克隆技術(shù)的應(yīng)用干細(xì)胞生產(chǎn)復(fù)制人體器官，即治療性克隆擴(kuò)大優(yōu)良畜群、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的數(shù)量拯救瀕危野生動(dòng)物為細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科提供實(shí)驗(yàn)手段和遺傳均質(zhì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用干細(xì)胞生產(chǎn)

盡管克隆技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用前景，但離產(chǎn)業(yè)化尚有很大距離。因?yàn)樽鳛橐粋€(gè)新興的研究領(lǐng)域，克隆技術(shù)在理論和技術(shù)上都還很不成熟，在理論上，分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過(guò)程）的機(jī)理還不清楚克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡，克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因，以及在克隆過(guò)程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問(wèn)題還沒(méi)有解決。克隆技術(shù)存在的問(wèn)題

盡管克隆技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用前景，但離產(chǎn)業(yè)化尚有很大距YourTopicGoesHereYoursubtopicgoeshereYourTopicGoesHereYoursubtoTransitionalPageTransitionalPageYourTopicGoesHereYoursubtopicgoeshereYourTopicGoesHereYoursubtoElementsElementswww.animationfactory.c第八章克隆動(dòng)物第八章克隆動(dòng)物克隆羊多利（Dolly）的誕生1997年2月，英國(guó)Roslin研究所宣布克隆羊多利（Dolly）的誕生揭示一個(gè)全新概念：由成年機(jī)體的一個(gè)體細(xì)胞核，可以復(fù)制一個(gè)基因完全相同的新生命個(gè)體。是克隆技術(shù)的里程碑。克隆一詞變得家喻戶曉克隆羊多利（Dolly）的誕生1997年2月，英國(guó)Rosli克隆來(lái)源于英語(yǔ)“clone”或“cloning”的音譯，起源于希臘文“Klone”，原意是用“插條”繁殖。曾譯為無(wú)性生殖或無(wú)性繁殖.克隆在分子、細(xì)胞、個(gè)體三個(gè)水平上克隆來(lái)源于英語(yǔ)“clone”或“cloning”的音譯，起源動(dòng)物克隆動(dòng)物克隆是指通過(guò)無(wú)性繁殖的手段，從一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞獲得遺傳背景相同的個(gè)體群的過(guò)程。獲得的個(gè)體群稱為克隆動(dòng)物（clonedanimal）動(dòng)物克隆動(dòng)物克隆是指通過(guò)無(wú)性繁殖的手段，從一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞獲得遺動(dòng)物克隆的研究歷史1、最初用胚胎分割的方法獲得克隆動(dòng)物。2、同卵雙生或孤雌生殖的方式獲得克隆動(dòng)物。3、通過(guò)核移植獲得克隆動(dòng)物，但開(kāi)始僅限于胚胎細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的克隆。4、1997年，克隆羊多莉的誕生，標(biāo)志著體細(xì)胞克隆的成功。5、現(xiàn)有多種體細(xì)胞克隆動(dòng)物誕生，如牛、豬、老鼠、貓、羊、兔、貓、狗等。動(dòng)物克隆的研究歷史1、最初用胚胎分割的方法獲得克隆動(dòng)物。1998年1月，美國(guó)威斯康星一麥迪遜大學(xué)的科學(xué)家們以牛的卵子為受體，成功克隆出豬、牛、羊、鼠和獼猴五種哺乳動(dòng)物的胚胎，這一研究結(jié)果表明，某個(gè)物種的未受精卵可以同取自多種動(dòng)物的成熟細(xì)胞核相結(jié)合。1999年，美國(guó)科學(xué)家用牛卵子克隆出珍稀動(dòng)物盤(pán)羊的胚胎；我國(guó)科學(xué)家也用兔卵子克隆了大熊貓的早期胚胎，在異種克隆研究領(lǐng)域，目前國(guó)際上僅有印度野牛和歐洲盤(pán)羊取得成功。到目前為止應(yīng)用異種核移植技術(shù)獲得的活體后代都來(lái)自于亞種間核移植。中國(guó)首例異體克隆動(dòng)物———瀕危動(dòng)物北山羊在新疆烏魯木齊縣六十戶鄉(xiāng)降生1998年1月，美國(guó)威斯康星一麥迪遜大學(xué)的科學(xué)家們以牛的卵子核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件獲得克隆動(dòng)物的方法1.胚胎分割2.孤雌生殖3.細(xì)胞核移植獲得克隆動(dòng)物的方法1.胚胎分割1.胚胎分割胚胎分割（embryosplitting）是指采用機(jī)械方法用特制的纖維刀片或玻璃微針將早期胚胎分割成2等分、4等分或多等分，再移植給受體母畜，從而獲得同卵多仔的一項(xiàng)胚胎工程技術(shù)。1.胚胎分割胚胎分割（embryosplitting）是指核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件胚胎分割——

一卵雙生

胚胎分割——一卵雙生

胚胎分割——

一卵雙生

胚胎分割——一卵雙生2.孤雌生殖孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵子不經(jīng)受精，直接發(fā)育為個(gè)體的繁殖方式。如：蚜蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)2.孤雌生殖孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵（一）偶發(fā)性孤雌生殖(sporadicparthenogenesis)：偶發(fā)性孤雌生殖是指某些昆蟲(chóng)在正常情況下行兩性生殖，但雌成蟲(chóng)偶爾產(chǎn)出的未受精卵也能發(fā)育成新個(gè)體的現(xiàn)象。常見(jiàn)的如家蠶、一些毒蛾和枯葉蛾等。

（二）經(jīng)常性孤雌生殖(constantparthenogenesis)：經(jīng)常性孤雌生殖也稱永久性孤雌生殖。這種生殖方式在某些昆蟲(chóng)中經(jīng)常出現(xiàn)，而被視為正常的生殖現(xiàn)象?？煞譃閮煞N情況：

1、在膜翅目的蜜蜂和小蜂總科的-些種類(lèi)中，雌成蟲(chóng)產(chǎn)下的卵有受精卵和未受精卵兩種，前者發(fā)育成雌蟲(chóng)，后者發(fā)育成雄蟲(chóng)。

2、有的昆蟲(chóng)在自然情況下，雄蟲(chóng)極少，甚至尚未發(fā)現(xiàn)雄蟲(chóng)，幾乎或完全行孤雌生殖，如一些竹節(jié)蟲(chóng)、粉虱、蚧、薊馬等。

（一）偶發(fā)性孤雌生殖(sporadicparthenog（三）周期性孤雌生殖(cyclicalparthenogenesis)：周期性孤雌生殖也稱循環(huán)性孤雌生殖。昆蟲(chóng)通常在進(jìn)行1次或多次孤雌生殖后，再進(jìn)行1次兩性生殖。這種以兩性生殖與孤雌生殖交替的方式繁殖后代的現(xiàn)象，又稱為異態(tài)交替(heterogeny)或世代交替(alternationofgenerations)。如棉蚜從春季到秋末，行孤雌生殖10一20余代，到秋末冬初則出現(xiàn)雌、雄兩性個(gè)體，并交配產(chǎn)卵越冬。（三）周期性孤雌生殖(cyclicalpartheno蜥蜴蜥蜴蚜蟲(chóng)蚜蟲(chóng)

問(wèn)題在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生了分化，但是在適宜環(huán)境下，已分化的細(xì)胞能否重新恢復(fù)到發(fā)育的起始狀態(tài)，再重新發(fā)育成其它類(lèi)型細(xì)胞組織的多能性，甚至發(fā)育成完整個(gè)體的全能性呢？細(xì)胞的分化是不是發(fā)生了不可逆的變化？問(wèn)題在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生HANSSPEMANN

1935NobelLaureateinMedicine

forhisdiscoveryoftheorganizereffectinembryonicdevelopment.

1869-1941

Residence:Germany

Affiliation:UniversityofFreiburgimBreisgau

德國(guó)胚胎學(xué)家Spemann提出通過(guò)核移植可以驗(yàn)證不同發(fā)育階段和不同分化程度的細(xì)胞核是否具有全能性。HANSSPEMANN

3.細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植（nucleartransfer）是指將早期胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞或成體動(dòng)物的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，重新組成重構(gòu)胚（reconstructedembryo）或克隆胚（clonedembryo）并使之發(fā)育成成體動(dòng)物的過(guò)程。

3.細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植（nucleartrans提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核供體（donor）接受細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核受體（recipient）核供體：胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、體細(xì)胞（somaticcell）核受體：早期胚胎細(xì)胞、受精卵、MII期卵母細(xì)胞提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核供體（donor）核供體：胚胎減數(shù)分裂分裂期：減數(shù)分裂期Ⅰ：前期Ⅰ、前中期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ和胞質(zhì)分裂期Ⅰ等6個(gè)階段。減數(shù)分裂期Ⅱ：前期Ⅱ、前中期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末期Ⅱ和胞質(zhì)分裂期Ⅱ等6個(gè)階段。前期Ⅰ：細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期5個(gè)階段。減數(shù)分裂分裂期：核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件供體細(xì)胞的細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞后，在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下，發(fā)生了重編程回復(fù)到發(fā)育的起點(diǎn)狀態(tài)。核重編程的過(guò)程就是使在體細(xì)胞中被關(guān)閉,而在正常胚胎發(fā)育中表達(dá)的基因重新被激活的過(guò)程.核移植的機(jī)理供體細(xì)胞的細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞后，在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下，重編程有三種可能的結(jié)果（1）供核基因組完全沒(méi)有進(jìn)行重編程重構(gòu)胚很快死亡；（2）部分重編程,重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡；

（3）完全重編程,產(chǎn)生正常的克隆動(dòng)物。重編程有三種可能的結(jié)果（1）供核基因組完全沒(méi)有進(jìn)行重編程細(xì)胞核移植分類(lèi)根據(jù)核供體細(xì)胞來(lái)源的不同

1.胚胎細(xì)胞核移植

2.胎兒細(xì)胞核移植

3.體細(xì)胞核移植（SCNT）根據(jù)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞是否來(lái)源于同一種動(dòng)物又可將其分為

1.同種核移植2.異種核移植細(xì)胞核移植分類(lèi)根據(jù)核供體細(xì)胞來(lái)源的不同顯微操作儀（micromanipulator）顯微操作儀（micromanipulator）胚胎細(xì)胞核移植

胚胎細(xì)胞核移植(embryocelluncleartransplantation)是指，將一個(gè)早期胚胎的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。胚胎細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞核移植(embryocell胚胎細(xì)胞核移植流程圖胚胎細(xì)胞核移植流程圖歷史回顧1938年Spemann提出設(shè)想：分化了的細(xì)胞核移植能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育？1952年Briggs和King在兩棲動(dòng)物證實(shí)了Spemann提出的設(shè)想：利用已分化的蛙囊胚細(xì)胞核移植到去核的蛙卵母細(xì)胞中，得到了重新發(fā)育的結(jié)果，從而證明了不同時(shí)期的胚胎細(xì)胞核在相同的卵質(zhì)中具有重新發(fā)育的能力，在特定條件下，可以恢復(fù)其發(fā)育的全能性。歷史回顧1938年Spemann提出設(shè)想：分化了的細(xì)胞核移植1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾門(mén)澤、美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，首次對(duì)小鼠胚胎細(xì)胞進(jìn)行核移植獲得成功。此后，胚胎細(xì)胞的核移植在多種動(dòng)物上獲得了克隆后代，如綿羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。直到1997年才由Mengetal成功地克隆出兩只猴,這是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的首次被克隆。1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾門(mén)澤、美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，首次

直至此時(shí),核移植所用的供體細(xì)胞均為囊胚階段以前的胚胎細(xì)胞。當(dāng)時(shí)人們普遍認(rèn)為，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后則隨著分化而逐漸喪失其全能性。直至此時(shí),核移植所用的供體細(xì)胞均為囊胚階段以前的胚胎細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞群2.雌原核與雄原核融合3.卵裂開(kāi)始4.2細(xì)胞期極體透明帶極體卵裂球受精卵原核卵周腔5.4細(xì)胞期6.8細(xì)胞期滋養(yǎng)層7.桑椹胚胚泡腔8.囊胚1.雌原核與雄原核形成

內(nèi)細(xì)胞群2.雌原核與雄原核融合3.卵裂開(kāi)始4.2細(xì)胞體細(xì)胞核移植技術(shù)動(dòng)物克隆技術(shù)的里程碑體細(xì)胞核移植技術(shù)動(dòng)物克隆技術(shù)的里程碑

體細(xì)胞核移植技術(shù)(somaticcelluncleartransplantation)是指，將分化程度較高的體細(xì)胞移植入去核的卵母細(xì)胞中構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。體細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植技術(shù)(somaticcellunclea歷史回顧1996年，世界第一例從成年動(dòng)物細(xì)胞克隆出的哺乳動(dòng)物綿羊多莉誕生。這個(gè)秘密直到1997年2月才向世人公布。1997年7月，蘇格蘭科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將一個(gè)人類(lèi)基因?qū)刖d羊體細(xì)胞，克隆了帶有人類(lèi)基因的綿羊“波莉”。歷史回顧1996年，世界第一例從成年動(dòng)物細(xì)胞克隆出的哺乳動(dòng)物1998年7月，美國(guó)夏威夷大學(xué)Wakayama等報(bào)道，由小鼠卵丘細(xì)胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多莉”以后的第二批哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植后代。此后，體細(xì)胞核移植技術(shù)在牛、山羊、豬等多種動(dòng)物獲得成功。至1999年底，全世界已有6種類(lèi)型細(xì)胞——胎兒成纖維細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、輸卵管／子宮上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和耳部皮膚細(xì)胞的體細(xì)胞克隆后代成功誕生。1998年7月，美國(guó)夏威夷大學(xué)Wakayama等報(bào)道，由小多莉的誕生過(guò)程多莉的誕生過(guò)程核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件體細(xì)胞核移植程序核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備重構(gòu)胚的激活重構(gòu)胚的培養(yǎng)移植給代孕動(dòng)物去核卵母細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控后的體細(xì)胞融合后形成重構(gòu)胚裝核體細(xì)胞核移植程序核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備重構(gòu)胚的激核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件1.核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備常用的體細(xì)胞有：卵丘細(xì)胞顆粒細(xì)胞皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞在體外一般在體外傳代8-16次1.核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備常用的體細(xì)胞有：A

組織塊培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞

B消化培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞

A組織塊培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞B消化培養(yǎng)的人皮膚2.細(xì)胞周期的調(diào)控1.血清饑餓法2.Aphidicolin（阿菲迪霉素）法3.激活卵母細(xì)胞法2.細(xì)胞周期的調(diào)控1.血清饑餓法核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆匯總課件3.受體細(xì)胞準(zhǔn)備目前為止，有三類(lèi)用于核移植產(chǎn)生了后代第一類(lèi)是去除原核的受精卵第二類(lèi)是早期胚胎；第三類(lèi)即是MⅡ期的卵母細(xì)胞。常用的是MⅡ期的卵母細(xì)胞，一般通過(guò)超數(shù)排卵和體外成熟培養(yǎng)獲得3.受體細(xì)胞準(zhǔn)備目前為止，有三類(lèi)用于核移植產(chǎn)生了后代4.去核的方法1.盲吸法2.半卵法3.熒光引導(dǎo)核法4.微分干涉顯微鏡去核法5.功能性去核法6.離心去核法7.末期去核法4.去核的方法1.盲吸法盲吸去核法一般將脫去顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞用含7.5ug/mlCB的培養(yǎng)液中清洗3-4遍后移入100ul左右的上述溶液的液滴中，同時(shí)將供體細(xì)胞加入液滴中。石蠟油覆蓋后于顯微操作儀上用固定針吸住卵母細(xì)胞，用去核針撥動(dòng)之，使第一極體位于1點(diǎn)位置；去核針從3點(diǎn)處進(jìn)針，針尖斜面部分刺入卵泡內(nèi)，吸出第一極體及其下方的1/4-1/3胞質(zhì)（包括細(xì)胞核）；然后從操作液中吸取形態(tài)圓，邊緣略粗糙的核供體細(xì)胞，從原針吸口處注入透明帶下并輕壓透明帶。去核舉例去核舉例MII期卵母細(xì)胞MII期卵母細(xì)胞去核過(guò)程去核過(guò)程5.裝核將準(zhǔn)備好的體細(xì)胞放入去核卵母細(xì)胞的過(guò)程。將體細(xì)胞放入帶下5.裝核將準(zhǔn)備好的體細(xì)胞放入去核卵母細(xì)胞的過(guò)程。將體細(xì)胞放入ABCDEFA顯微注射針刺入卵母細(xì)胞前B開(kāi)始吸取第一極體C極體已被吸入注射針D去除極體后的卵母細(xì)胞E注射供體細(xì)胞F供體細(xì)胞已被注入透明帶下ABCDEFA顯微注射針刺入卵母細(xì)胞前B開(kāi)始吸取第一直接注射法直接注射法6.細(xì)胞融合

細(xì)胞融合的方法有：病毒介導(dǎo)融合化學(xué)融合電融合6.細(xì)胞融合細(xì)胞融合的方法有：利用電穿孔的原理來(lái)使細(xì)胞融合。為使供/受體細(xì)胞的接觸面與電場(chǎng)方向垂直,更有利于融合,可在待融的供/受體復(fù)合物移入兩微電極絲所組成的融合小槽內(nèi)后用一次交流脈沖或手工排步的方式來(lái)達(dá)到這一目的。電融合舉例利用電穿孔的原理來(lái)使細(xì)胞融合。為使供/受體細(xì)胞的卵母細(xì)胞與體細(xì)胞電融合過(guò)程卵母細(xì)胞與體細(xì)胞電融合過(guò)程7.重構(gòu)卵激活正常情況下,受精過(guò)程中，精子進(jìn)入卵子后,卵母細(xì)胞質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)一系列的反應(yīng),如游離Ca2+濃度增高、母源性的mRNA啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、MPF等因子活性下降等。這些反應(yīng)是卵母細(xì)胞被激活的標(biāo)志，不經(jīng)過(guò)這些變化,胚胎就不能正常發(fā)育。核移植過(guò)程中的激活就是模仿受精過(guò)程中精子的刺激作用。目前，激活的方式有電激活、化學(xué)激活和注射精子因子激活三種。化學(xué)激活常用藥品有：鈣離子載體（A23187