南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)課件(2)課件

第三節(jié)Oxidativephosphorylation一.氧化磷酸化的機理Whatisoxidativephosphorylation氧化磷酸化（oxidativephosphorylation）是指細(xì)胞內(nèi)伴隨有機物氧化，利用生物氧化過程中釋放的自由能，促使ADP與無機磷酸結(jié)合生成ATP的過程。

？一.氧化磷酸化的機理20世紀(jì)30年代包括德國生物化學(xué)家、諾貝爾獎獲得者Meyerhof&Warburg在內(nèi)的許多生化學(xué)家對代謝過程中能量的產(chǎn)生和利用作了深入研究，發(fā)現(xiàn)無論在糖酵解或三羧酸循環(huán)等代謝過程中，都有伴隨著ATP磷酸根的放出或

ADP得到磷酸根的變化這類化學(xué)能量高效率的傳遞方式，指出腺苷三磷酸（ATP）是代謝中能量產(chǎn)生和利用的關(guān)鍵化合物。一.氧化磷酸化的機理1941年FritzLipmann引入“高能磷酸鍵

(～P)”的概念。1949年美國生化學(xué)家EugeneKennedy和AlbertLehninger發(fā)現(xiàn)線粒體含有三羧酸循環(huán)和呼吸鏈所需要的全部酶系統(tǒng)，并且發(fā)現(xiàn)生物氧化與ADP磷酸化相偶聯(lián)構(gòu)成了氧化磷酸化。但是，NADH的氧化和電子傳遞過程是如何與ADP磷酸化生成ATP反應(yīng)偶聯(lián)起來一直不清楚。一.氧化磷酸化的機理關(guān)于這一問題目前至少有三種假說比較著名的假說有三個：化學(xué)偶聯(lián)假說構(gòu)象偶聯(lián)假說化學(xué)滲透學(xué)說目前得到公認(rèn)的是“化學(xué)滲透學(xué)說”。這個假說是1953年由EdwardSlater最先提出。假說認(rèn)為在NADH氧化和電子傳遞過程中產(chǎn)生了一種活潑的高能共價中間物，通過此中間物進一步氧化產(chǎn)生的能量來驅(qū)動ATP的合成。這一假說完全是依據(jù)底物水平磷酸化機理提出的，例如在糖酵解中，由3-磷酸甘油醛脫氫酶催化的反應(yīng)就產(chǎn)生了一種活潑且具有高能磷酸基轉(zhuǎn)移勢能的?；姿峄衔?，3-二磷酸甘油，隨后其分子中的高能磷酸基團在磷酸甘油酸激酶的作用下被轉(zhuǎn)移到ADP生成ATP。雖然在糖酵解過程中存在這種例證，但是人們至今未能在線粒體中分離到與之相類似的高能共價中間物?；瘜W(xué)偶聯(lián)假說Chemicalcouplinghypothesis

這個假說是1964年由P.D.Boyer提出。該假說認(rèn)為作為電子傳遞體的蛋白質(zhì)有兩種不同的構(gòu)象：低能構(gòu)象和高能構(gòu)象。電子傳遞的結(jié)果使低能構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軜?gòu)象，后者再將能量傳遞給F0-F1-ATP合成酶，使之也發(fā)生構(gòu)象變化，從而推動ADP磷酸化形成ATP。這種假說有一定的實驗根據(jù)，在電子沿呼吸鏈流動時，觀察到線粒體內(nèi)膜發(fā)生迅速的物理變化，但由于測定構(gòu)象比較困難，支持這個假說的實驗太少。構(gòu)象偶聯(lián)假說Conformationalcouplinghypothesis

英國生物化學(xué)家PeterDMitchell在1961年提出化學(xué)滲透假說，由于該假說提出后逐漸擁有越來越多的實驗證據(jù)，因而成為目前解釋氧化磷酸化偶聯(lián)機理最為公認(rèn)的一種假說，并且PeterMitchell因提出該假說而獲得了1978年的諾貝爾化學(xué)獎。

化學(xué)滲透學(xué)說

Chemiosmotichypothesis

電子傳遞體在線粒體內(nèi)膜上有著不對稱分布，傳氫體和傳電子體交替排列，催化是定向的；Chemiosmotichypothesis—keypoints一.氧化磷酸化的機理復(fù)合物I、III、IV將H+從基質(zhì)內(nèi)泵向內(nèi)膜的外側(cè)，而將電子傳向其后的電子傳遞體；化學(xué)滲透學(xué)說一.氧化磷酸化的機理內(nèi)膜對質(zhì)子不具有通透性，這樣在內(nèi)膜兩側(cè)形成質(zhì)子濃度梯度，這就是推動ATP合成的原動力；化學(xué)滲透學(xué)說一.氧化磷酸化的機理當(dāng)存在足夠高的跨膜質(zhì)子化學(xué)梯度時，強大的質(zhì)子流通過F1-F0-ATPase進入基質(zhì)時，釋放的自由能推動ATP合成。化學(xué)滲透學(xué)說一.氧化磷酸化的機理ThereconstitutedvesiclescontainingATPsynthaseandbacteriorhodopsin,alight-drivenprotonpump,reportedbyEfraimRackerandWaltherStoeckeniusin1974化學(xué)滲透學(xué)說(min)0306090120A492-0,06-0,04-0,020,000,02ATPGramicidinAOADP+PAOH+AOH+ATPi一.氧化磷酸化的機理

F1：球形頭部，伸入線粒體基質(zhì)，由五種亞基組成33,是ATP合酶的催化部分；

F0:

橫貫線粒體內(nèi)膜，含有質(zhì)子通道，由十多種亞基組成。位于F1與F0之間的柄含有寡霉素敏感性蛋白。F1-F0-ATPase復(fù)合物一.氧化磷酸化的機理

由上述化學(xué)滲透假說可知，該模型必需具備兩個條件：一是線粒體內(nèi)膜必須是質(zhì)子不能透過的封閉系統(tǒng)，否則質(zhì)子梯度將不復(fù)存在；二是要求呼吸鏈和ATP合酶在線粒體內(nèi)膜中定向地組織在一起，并定向地傳遞質(zhì)子、電子和進行氧化磷酸化反應(yīng)。

重要一.氧化磷酸化的機理

目前這兩方面都獲得了一些實驗證據(jù)，例如能攜帶質(zhì)子穿過線粒體內(nèi)膜的物質(zhì)（如2,4-二硝基苯酚）可破壞線粒體內(nèi)膜對質(zhì)子的透性壁壘，使質(zhì)子電化學(xué)梯度消失。

另外根據(jù)測算，膜間隙的pH較內(nèi)膜低1.4個單位，并且線粒體內(nèi)膜兩側(cè)原有的外正內(nèi)負(fù)跨膜電位升高。重要一.氧化磷酸化的機理F1-F0-ATPase復(fù)合物P/O(磷氧比)：在生物氧化過程中，伴隨ADP磷酸化所消耗的無機磷酸的磷原子數(shù)與消耗的分子氧的氧原子數(shù)之比。即每消耗1個氧原子所產(chǎn)生的ATP的分子數(shù)。

二.氧化磷酸化的P/O比測定結(jié)果表明：NADH經(jīng)呼吸鏈完全氧化時，P/O為3，即1分子的NADH通過呼吸鏈將電子最終傳遞給O2可產(chǎn)生3個ATP；二.氧化磷酸化的P/O比二.氧化磷酸化的P/O比FADH2經(jīng)呼吸鏈完全氧化時，P/O為2，即1分子的FADH2通過呼吸鏈將電子最終傳遞給O2可產(chǎn)生2個ATP。為什么？二.氧化磷酸化的P/O比為什么？二.氧化磷酸化的P/O比

但是,近年來很多實驗結(jié)果都證明，以NADH作為電子供體時，測得的P/O比值大于2。以琥珀酸作為電子供體時，側(cè)得的P/O比值大于1；所以P/O比值不一定是整數(shù)。例如，-羥丁酸經(jīng)過NADH途徑的P/O比值為2.4~2.6，產(chǎn)生的ATP數(shù)目為2.5；而琥珀酸經(jīng)過FADH2的P/O比值為1.7，產(chǎn)生的ATP數(shù)目為1.5。

二.氧化磷酸化的P/O比因此，雖然電子轉(zhuǎn)移伴隨著ATP的合成，但不能僅以P/O比值作為ATP生成數(shù)的依據(jù)，而應(yīng)考慮一對電子從NADH或FADH2傳遞到氧的過程中，有多少質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵出，以及有多少質(zhì)子必須通過ATP合酶返回基質(zhì)以用于ATP的合成，這樣才能從本質(zhì)上確定ATP的生成數(shù)量。

二.氧化磷酸化的P/O比

目前被廣泛接受的觀點是：ATP、ADP和無機磷酸通過線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運是由ATP-ADP載體和磷酸轉(zhuǎn)位酶催化的。已知每合成1個ATP需要3個質(zhì)子通過ATP合酶。與此同時，把一個ATP分子從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)運到胞液需要消耗1個質(zhì)子，所以每形成1個分子的ATP就需要4個質(zhì)子的流動。因此，如果一對電子通過NADH電子傳遞鏈可泵出10個質(zhì)子，則可形成2.5個分子ATP；如果一對電子通過FADH2電子傳遞鏈有6個質(zhì)子泵出，則可形成1.5個ATP分子。三.ATP酶-構(gòu)象偶聯(lián)假說

該假說是1964年由美國生物化學(xué)家PaulBoyer最先提出，他認(rèn)為電子傳遞過程中，線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)組分發(fā)生了構(gòu)象變化，轉(zhuǎn)變成一種高能形態(tài)。這種高能形態(tài)通過將能量轉(zhuǎn)移到ADP合成ATP后，又得以恢復(fù)其原來的構(gòu)象。隨著人們對ATP合酶結(jié)構(gòu)的研究和認(rèn)識不斷深入，在構(gòu)象偶聯(lián)假說的基礎(chǔ)上形成了ATP合酶結(jié)合變化和旋轉(zhuǎn)催化假說。三.ATP酶-構(gòu)象偶聯(lián)假說

ATP合酶結(jié)合變化和旋轉(zhuǎn)催化假說認(rèn)為，ATP合酶與底物核苷酸的作用是按照結(jié)合變化機理進行的。構(gòu)成ATP合酶頭部的α3β3亞基構(gòu)成3個催化部位，中部的γε亞基在質(zhì)子推動力的驅(qū)動下相對于α3β3作旋轉(zhuǎn)運動。由于3個β亞基與γε亞基的不對稱接觸，使其分別處于三種不同的狀態(tài)，即無核苷酸結(jié)合的空置狀態(tài)（O）、結(jié)合ADP+Pi的松散結(jié)合狀態(tài)（L）和結(jié)合ATP的緊密結(jié)合狀態(tài)（T）。Rotationofgleadstosequentialbindingchangesforeachbsubunit.三.ATP酶-構(gòu)象偶聯(lián)假說

當(dāng)質(zhì)子推動力驅(qū)使H+經(jīng)F0質(zhì)子通道進入時，F(xiàn)0組分質(zhì)子化而發(fā)生構(gòu)象改變，積累足夠的扭矩力，推動γε相對α3β3旋轉(zhuǎn)120°，使處于T態(tài)的催化部位釋放ATP變成O態(tài)，同時L態(tài)催化部位上生成ATP變?yōu)門態(tài)，O態(tài)結(jié)合ADP+Pi變?yōu)長態(tài)gggBoyerThebinding-changemodelwaselegantlysupportedbytwootherexperimentalobservationsX-raycrystallographyrevealedthatthethreebsubunitsofF1assumesthreedifferentconformations,withboundADP,ATPanalog,oremptyrespectively.Rotationsofthegsubunitandthec-ringoftheF1unitinthreediscretestepsof120o(asbeingpoweredbyATPhydrolysiscatalyzedbythebsubunits)havebeendirectlyobservedusingfluorescencemicroscopy(1997)Rod-shapedgsubunit.ADPApp(NH)pEmptyStructuredeterminationindicatesthatindeedthethreebsubunitsareinequivalentinconformation!(JohnWalker,1994)T(tight)L(loose)O(open)Rotationoftheg

subunitandtheringofcsubunitsintheFoF1complexwasobservedbyinvitrostudiesusingfluorescencemicroscopy(K.Kinosita,1997)a3b3g,withthegsubunitlinkedtoanactinfilamentwillalsorotatewhenATPisadded.FluorescencetlylabeledTheworld’ssmallestmolecularmotor:rotationalcatalysis.Modelontherotationofthec-ringinATPsynthase:twohalf-channelsforH+ontheasubunithasbeenproposed.(3ATPmadeper10-14protonstransported:~3H+/ATP.)Asp

1.解偶聯(lián)劑

解偶聯(lián)劑（uncoupler）是指那些不阻斷呼吸鏈的電子傳遞，但能抑制ADP通過磷酸化作用轉(zhuǎn)化為ATP的化合物。它們也被稱為氧化磷酸化解偶聯(lián)劑。

最早發(fā)現(xiàn)的一個解偶聯(lián)劑是2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol,DNP），它是一種弱酸性親脂化合物，在pH7條件下，DNP以解離形式存在，不能通過線粒體內(nèi)膜。但是在酸性環(huán)境中，DNP轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄缘姆墙怆x形式，可攜帶質(zhì)子透過線粒體內(nèi)膜。這樣就破壞了電子傳遞形成的跨膜質(zhì)子電化學(xué)梯度四、氧化磷酸化的抑制1.解偶聯(lián)劑

在解偶聯(lián)劑存在時，電子沿呼吸鏈的傳遞能正常進行，但不能偶聯(lián)產(chǎn)生ATP，這樣就使電子傳遞所產(chǎn)生的自由能以熱能的形式被消耗。由于DNP解偶聯(lián)劑只專一性地抑制與呼吸鏈相偶聯(lián)的ATP的形成過程，因此，它不會影響底物水平的磷酸化。四、氧化磷酸化的抑制

這類化合物直接作用于ATP合酶復(fù)合體，從而抑制ATP的合成。它們使膜外質(zhì)子不能通過ATP合酶復(fù)合體返回膜內(nèi)，使膜內(nèi)質(zhì)子繼續(xù)泵出到膜外顯然越來越困難，最后不得不停止，所以這類抑制劑間接抑制了電子傳遞和分子氧的消耗。

寡霉素屬于此類抑制劑，它與F0的一個亞基結(jié)合而抑制F1。2.氧化磷酸化抑制劑四、氧化磷酸化的抑制3.離子載體抑制劑

離子載體抑制劑（ionophore）是指那些能與某種離子結(jié)合，并作為這些離子的載體攜帶離子穿過線粒體內(nèi)膜的脂雙層進入線粒體的化合物。這類抑制劑均是脂溶性物質(zhì)，它們與解偶聯(lián)劑的區(qū)別在于它們能結(jié)合除H+以外的其它一價陽離子，例如纈氨霉素（Valinomycin）可結(jié)合K+，短桿菌肽可結(jié)合K+、Na+和其它一價陽離子穿過線粒體內(nèi)膜。因此離子載體抑制劑增大了線粒體內(nèi)膜對一價陽離子的通透性，從而破壞了膜兩側(cè)的電位梯度，最終導(dǎo)致氧化磷酸化過程被抑制。四、氧化磷酸化的抑制五.電子傳遞抑制劑

凡是能夠阻斷電子傳遞鏈中某部位電子傳遞的物質(zhì)稱為電子傳遞抑制劑，由于阻斷部位物質(zhì)的氧化還原狀態(tài)能被測定，所以利用電子傳遞抑制劑是研究電子傳遞順序的重要方法，下面列舉了若干種常見的重要的電子傳遞抑制劑。1、魚藤酮等阻斷從NADH向CoQ的傳遞魚藤酮（rotenone）、安密妥（amytal）、殺粉蝶菌素（piericidine）等。它們的作用是抑制復(fù)合物I，阻斷電子由NADH向CoQ的傳遞，但不影響FADH2到CoQ的氫傳遞。魚藤酮是一種極毒的植物毒素，常用作殺蟲劑。五.電子傳遞抑制劑2、抗霉素A

阻斷復(fù)合物III的電子傳遞抗霉素A（antimycinA），它是從灰色鏈球菌分離出的一種抗生素，抑制復(fù)合物Ⅲ的電子傳遞，即阻斷細(xì)胞色素還原酶中電子的傳遞，從而抑制了電子從還原型的CoQ（QH2）到細(xì)胞色素c1的傳遞。五.電子傳遞抑制劑3、氰化物、疊氮化物、CO、H2S

阻斷復(fù)合物IV向O