CarT細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程

CarT細(xì)胞培育標(biāo)準(zhǔn)操作流程CarT細(xì)胞培育標(biāo)準(zhǔn)操作流程CarT細(xì)胞培育標(biāo)準(zhǔn)操作流程Car-T細(xì)胞培育標(biāo)準(zhǔn)操作流程1目的：保證Car-T細(xì)胞制備和培育符合要求。2范圍：合用于符合實驗的要求患者外周血制備和培育3責(zé)任人：實驗員人、臨床有關(guān)人員。4內(nèi)容耗材：50ml離心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培育瓶，150cm2培育瓶，EP管，1.8ml凍存管試劑：X-VIVO15TM，PBS緩沖液，75%醫(yī)用酒精，人淋巴細(xì)胞分別液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。環(huán)境：外周血分別，培育應(yīng)在恒溫恒濕的萬級層流室內(nèi)進(jìn)行，開放操作必然在百級生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。實驗人員應(yīng)提早對凈化室和生物安全柜進(jìn)行殺菌消毒，紫外線照耀時間好多于30min，消毒消毒后，凈化空調(diào)開啟時間好多于30min，生物安全柜運轉(zhuǎn)穩(wěn)定前面可操作。操作：采集接收外周血患者符合治療方案，各項檢測符合要求，采集患者外周血60-80ml。接收外周血并填寫?外周血采集交接記錄?，查對外周血患者有關(guān)信息，及相應(yīng)檢測報告，報告由醫(yī)院供給，最少包含：HBsAg，HCVA，bHIVAb，Anti-TP，ALT。操作前準(zhǔn)備凈化室，生物安全柜消毒完成后，開啟凈化空調(diào)運轉(zhuǎn)30min，生物安全柜運轉(zhuǎn)堅固。從試劑間冰箱中拿出細(xì)胞培育基，恢復(fù)室溫。生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒轉(zhuǎn)入安全柜內(nèi)。分別單個核細(xì)胞〔PBMC〕：使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或許使用一次性注射器，把血袋1/3內(nèi)外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中。4.4.3.2用PBS緩沖液按1:1稀釋外周血，混勻。將稀釋好的血樣遲緩參加室溫的15ml人淋巴細(xì)胞分別液的離心管中。方法以下：用10ml移液管汲取血樣，伸至分別液液面上方處，血樣自然滑落鋪至分別液面上，此后輕輕參加血樣，注意不要打破液面。配平離心1200g〔2100r/min〕離心20min，慢升慢降。離心完成后，離心管出現(xiàn)顯然分層由下至上：紅細(xì)胞層，粒細(xì)胞層，F(xiàn)icoll層，單個核細(xì)胞層和血漿層。汲取血漿層至距白膜層5mm左右處棄之。當(dāng)心汲取紅細(xì)胞層以上的所有液體至離心管中，PBS稀釋，與細(xì)胞懸液體積比應(yīng)大于1:3，混勻。離心600g〔1600r/min〕5min，PBS重懸細(xì)胞混勻，取少許細(xì)胞計數(shù)。離心300g〔1200r/min〕5min，上清液送檢無菌檢測。細(xì)胞培育：細(xì)胞培育條件：恒溫37℃，CO2濃度5%，相對飽和濕度95%，細(xì)胞培育基PH值。依據(jù)細(xì)胞計數(shù)調(diào)密度2x106/ml參加培育瓶中〔T150200x106/100ml,T75100x106/50ml,T2550x106/25ml〕。混勻放入CO2培育箱培育2小時。拿出培育瓶，輕搖，使沉降于底部的懸浮細(xì)胞浮起，培育瓶傾斜30度角，移液管汲取培育基轉(zhuǎn)入離心管中，少些培育基洗培育瓶將懸浮細(xì)胞所有采集，混勻計數(shù)。依據(jù)細(xì)胞計數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度接種培育瓶中〔100-120mlinaT150，50-60mlinaT75，15-29mlinaT25〕，加CD3/CD28磁珠，按細(xì)胞與磁珠比率為1:3〔加以前磁珠用培育基沖刷3次，去除保留液〕，參加IL-2100U/ml，混勻放入CO2培育箱培育。第二天細(xì)胞培育1天，調(diào)整細(xì)胞密度至，參加病毒〔MOI為1-5〕混勻放入CO2培育箱培育。細(xì)胞培育3天，細(xì)胞計數(shù)補(bǔ)加培育基，IL-2100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至連續(xù)培育。2/3細(xì)胞培育5天去磁珠，細(xì)胞混勻轉(zhuǎn)離心管中，在磁力架上去除磁珠，細(xì)胞計數(shù)補(bǔ)加培育基，IL-2100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至連續(xù)培育。按期察看細(xì)胞生長狀況，主要察看其形態(tài)的變化，數(shù)目及增值狀況，細(xì)胞碎片及雜質(zhì)狀況，每2-3天加液培育。依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和臨床治療需要，培育9節(jié)氣細(xì)胞數(shù)目抵達(dá)要求，各項檢測合格。包含：無菌檢測，內(nèi)毒素檢測，細(xì)胞活力，細(xì)胞表型等。4.4.5Car-T細(xì)胞采集：確認(rèn)細(xì)胞各項檢測己符合要求。依據(jù)治療方案〔一般一個療程分頻頻回輸，間隔時間為1天〕，拿出相應(yīng)細(xì)胞懸液，節(jié)余細(xì)胞補(bǔ)加培育基連續(xù)培育，供再次回輸。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，300g離心5min。除掉上清培育液，加PBS緩沖液稀釋混勻，300g離心5min，棄上清，PBS緩沖液300g/min離心5min。細(xì)胞裝袋〔一般靜脈回輸，采納100ml雙閥鹽水袋〕，離心完成后取上清，做無菌檢測，20ml生理鹽水重懸細(xì)胞，100μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，取少許細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞活率，革蘭氏檢測，內(nèi)毒素檢測。細(xì)胞過濾完成，轉(zhuǎn)入100ml鹽水袋中，加5%注射用人血白蛋白，貼上標(biāo)簽，并填寫有關(guān)記錄。細(xì)胞運輸與保留：查對細(xì)胞標(biāo)簽內(nèi)容，填寫回輸發(fā)放記錄。細(xì)胞鹽水袋擱置于運輸容器內(nèi)〔一般為