糖的提取分離結(jié)構(gòu)測定

關于糖的提取分離結(jié)構(gòu)測定第1頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五一、提取

單糖、低聚糖及苷類化合物常用水或醇提取，然后用不同的有機溶劑萃取得到不同極性的化合物。多糖常用熱水、稀堿或稀酸溶液進行提取。植物體內(nèi)苷常與水解酶共存，所以要殺酶或抑制酶的活性。第2頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五提取流程第3頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五二、分離1.季銨鹽沉淀法與酸性多糖形成不溶性沉淀，使其分離。常用季氨鹽有十六烷基三甲胺溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。提高溶液PH值或加入硼砂緩沖液，也可沉淀分離中性多糖。第4頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五2.分級沉淀或分級溶解法按比例由小到大的順序向多糖溶液中加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉淀，反復溶解與沉淀。為了多糖的穩(wěn)定，一般在PH7時進行，酸性多糖在PH2-4時進行。第5頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五分級沉淀法得到的多糖，常含有較多的蛋白質(zhì)，需將其去除方法：選擇使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的試劑（如酚、三氯醋酸、鞣質(zhì)等）處理

sevag法：（用氯仿:丁醇5:1混合）酶解法：（蛋白水解酶，常與sevag法合用）三氟三氯乙烷法三氯醋酸法蛋白質(zhì)的去除第6頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五3.離子交換色譜常用交換劑為陽離子或陰離子交換纖維素。陽離子交換纖維素適用于分離酸性、中性多糖和粘多糖。中性多糖與硼酸絡合后可增加酸性，可被陽離子交換纖維素吸附酸性基團多的吸附力強，對于線性分子，分子量大的比小的吸附力強，直鏈分子比支鏈分子易吸附。第7頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五4.凝膠柱色譜

分子篩原理，按照分子量的大小不同進行分離。

常用葡聚糖凝膠（sephadexG）5.纖維素柱色譜（吸附＋分配）6.制備性區(qū)域電泳（分子大小、形狀、電荷不同，在電場作用下的遷移速率不同）第8頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五第六節(jié)糖的核磁共振性質(zhì)

第9頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五一、糖的1H-NMR性質(zhì)

1.1H-NMR化學位移糖的端基質(zhì)子信號在δ4.3~6.0甲基五碳糖的甲基信號在δ1.0左右糖上其余質(zhì)子信號在δ3.2~4.2之間。第10頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五2.化學位移的應用根據(jù)糖的端基質(zhì)子信號的個數(shù)和化學位移值可推測連有糖的個數(shù)、糖的種類。根據(jù)甲基質(zhì)子信號的個數(shù)和化學位移值可推測甲基五碳糖的個數(shù)、糖的種類。第11頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五3.偶合常數(shù)質(zhì)子的鄰位偶合常數(shù)與二面角有關兩面角90度J=0Hz；

兩面角0或180度J=6~8Hz；兩面角60度J=2~4Hz第12頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五當2-H為直立鍵時β-D-和α-L-型糖的1-H和2-H鍵為雙直立鍵，φ=180，J=6~8Hz第13頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五α-D-和β-L-型糖

1-H為e鍵，2-H為a鍵，φ=60，J=2~4Hz第14頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿洛糖的2-H均為直立鍵當其成α苷時，端基質(zhì)子與2-H的J約為4Hz；當其成β苷時，端基質(zhì)子與2-H的J約為8Hz。第15頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五2-H為e鍵，1-H無論處于e鍵還是a鍵，與2-H的兩面夾角均約60度，不能用J判斷苷鍵構(gòu)型。如D-甘露糖第16頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五L-鼠李糖優(yōu)勢構(gòu)象為1C式，2-H為平伏鍵，1-H與2-H的兩面夾角約60度，所以苷鍵的構(gòu)型不能J來判斷。第17頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五二、糖的13C-NMR性質(zhì)

1.化學位移

CH3

~18ppm甲基五碳糖的C6

CH2OH~62ppmC5或C6

CHOH68~85ppm糖氧環(huán)上的C2~C4

-O-CH-O-95~105ppm端基C1或C2

環(huán)上的碳，帶有a-OH的較帶有e-OH的出現(xiàn)在較高場處（尤其是端基碳，但不適于甘露糖、鼠李糖的端基碳）；第18頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五D-葡萄糖苷C1——α型97~101ppmβ型103~106ppm在13C-NMR譜中：

第19頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五2.偶合常數(shù)

（吡喃糖中端基碳的碳氫偶合常數(shù))

吡喃糖中端基質(zhì)子處于橫鍵（a-D或?-L型苷鍵）時，其端基碳氫的偶合常數(shù)為170~175Hz；處于豎鍵（?-D或a-L型苷鍵）時則為160~165Hz。鼠李糖相反（1C式）第20頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五3.苷化位移

糖與苷元成苷后，苷元的α-C、β-C和糖的端基碳的化學位移值均發(fā)生了改變，稱為苷化位移。第21頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五

如：

C1

位移

β-D-葡萄糖

96.7

甲基-β-D-葡萄糖苷104.0+8.3

β-D-半乳糖

97.3

甲基-β-D-半乳糖104.5+8.3

α-L-鼠李吡喃糖

95.1

甲基-α-L-鼠李糖苷102.6+7.5第22頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五醇型苷：端基碳的苷化位移與苷元醇羥基種類有關

α-Glc

β-Glc端基碳δC-1ΔδδC-1Δδ伯醇100.0+7.1104.4+6.7仲醇98.5+4.4102.3+3.5叔醇94.6+0.598.9+0.1

伯醇>仲醇>叔醇第23頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五①伯醇苷（成苷后）苷元α-C向低場位移約8個化學位移單位β-C向高場位移約4個化學位移單位第24頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五②環(huán)醇苷

前手性碳：對稱碳原子增加一個取代基后，變?yōu)榉菍ΨQ碳，這樣的碳原子稱之為前手性碳a.兩個β-C均為仲碳的苷成苷后α-C向低場位移7個單位，端基碳向高場位移約1~4個單位（與甲苷比），β-C的前手性構(gòu)型與端基碳構(gòu)型相同時，向高場位移約2個單位；不同時，向高場位移約4個單位。

同小異大：指β碳第25頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五b.一個β-C為仲碳，另一個為叔碳或季碳的苷

α-C與糖的端基碳構(gòu)型相同時，α-C向低場位移約5個單位；不同時α-C向低場位移約10個單位。β-C和端基碳的變化較復雜。同五異十其余七指：

α-C第26頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五③叔醇苷

成苷后α-C向低場位移約7個單位；β-C向高場位移約5個單位。④酯苷和酚苷苷元α-C向高場位移，區(qū)別于上述苷。

第27頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五第七節(jié)糖鏈的結(jié)構(gòu)測定第28頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五一、純度測定（多糖）

多糖純品實質(zhì)上是指一定分子量范圍的均一組分。

測定方法：

超離心法、高壓電泳法、凝膠柱色譜法、旋光測定法、官能團摩爾比恒定法等。第29頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五二、分子量測定

單糖、低聚糖及其苷的分子量測定主要采用質(zhì)譜法。多采用化學電離質(zhì)譜(CI-MS)、場解吸質(zhì)譜(FD-MS)、快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)等方法，ESI-MS及FAB-MS是目前測定苷類分子量常用的方法。應用甲基化法和過碘酸氧化法進行的末端分析法也常用來推算多糖的分子量第30頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五三、單糖的鑒定

一般是將苷鍵全水解，用PC檢出單糖的種類，糖類的PC常用的展開劑大多為含水的溶劑系統(tǒng)，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，經(jīng)顯色后用薄層掃描法求得各種糖的分子比。用GC或HPLC對單糖定性定量，GC常以甘露醇或肌醇為內(nèi)標，用已知單糖作為對照品。NMR譜，也可以有效地鑒定苷分子中糖的種類。第31頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五四、糖的連接位置的測定

1.甲基化法：

將被測物全甲基化，水解苷鍵，用GC定性定量分析，具有游離羥基的部位是糖的連接位點。2.1H-NMR法：

根據(jù)乙?；蟮馁|(zhì)子化學位移判斷糖的連接位點。3.13C-NMR法：

通過苷化位移，推斷糖的連接位點。第32頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五五、糖鏈連接順序的確定

1.部分水解法：將糖鏈水解成較小片段（低聚糖），然后分析片段推斷糖鏈的結(jié)構(gòu)。2.質(zhì)譜法根據(jù)質(zhì)譜中的裂解規(guī)律和裂解碎片推測糖鏈的連接順序。3.NMR和2D-NMR法。第33頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五2.質(zhì)譜法FDMS、FABMS等。優(yōu)點：不必制備衍生物,用量小,準確,簡便。第34頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五是將糖及其苷類衍生物全乙酰化后，測定觀察兩糖之間質(zhì)子的遠程偶合或NOE效應，確定糖的連接順序。3.NMR和2D-NMR法。通過HMBC可確定糖的連接位點。第35頁，共38頁，2022年，5月20日，16點23分，星期五六、苷鍵構(gòu)型及氧環(huán)的確定

1.苷鍵構(gòu)型確定方法包括：

1H-NMR法、酶解法、分子旋光差法等。

1H-NMR法

1利用端基質(zhì)子的偶合常數(shù)

2利用α-