人臍帶間充質(zhì)干細胞對感染狀態(tài)下人肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響

人臍帶間充質(zhì)干細胞對感染狀態(tài)下人肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響楊淑梅;鄭璇兒;楊浩鳴;盧春敏;賴衛(wèi)明;饒韻蓓;任竹瀟;楊杰【摘要】目的探討人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSC)對感染銅綠假單胞菌狀下人肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549)的影響.方法人肺泡Ⅱ型上皮細胞A549(1×105/mL)2mL與PA(3×104CFU/mL)2mL 共培育6h后加入hUCMSC(1×106/mL)2 mL為實驗組加入等量磷酸緩沖(PBS)為感染組,A549與PBS及培養(yǎng)基共培育為對照組比較組間A549細胞形態(tài)學(xué)改變透射電鏡),A549細胞存活率(CCK-8新型細胞增殖檢測試劑盒),A549細胞凋亡率(AnnexinV-FITC/PI雙染色流式細胞儀以及A549肺表面活性物質(zhì)A(SP-A)表達量(WesternA549A549A549細胞細胞存活率顯著降低[(70.35±2.89)%與(97.37±2.07)%,n=3,P<0.01],凋亡率顯著增加[(8.63%±0.16)%與(2.55±0.11)%,n=3,P<0.01],SP-A[(0.105±0.01)與(0.232±0.015),n=3,P<0.01];(70.35±2.89)%,n=3,P<0.01],凋亡率顯著下降與(8.63±0.16)%,n=3,P<0.01],感染組,PA可能損傷A549細胞使其SP-A表達量著減少(n=5,P<0.05),實驗組中,hUCMSC 可能對感染后A549細胞的保護作其SP-A表達量增加結(jié)論]hUCMSC 能抑制感染狀態(tài)下的A549細胞凋亡保護A549細胞分泌SP-A.%[Objective]Toinvestigatetheeffectofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsoninfectedstateofhumanalve?olartypeⅡepithelialcells.[Methods]HumanalveolartypeⅡepithelialcellsA549(1×105/mL)2mLandPA(3×104CFU/mL)2mLhasgrownafter6hours,addhUCMSC(1×106/mL)2mLastheexperimentalgroup,addequalamountsofphosphatebuffer(PBS)forinfection,A549PBSandthemediumhasgrownasthecontrolgroup.A549cellsmorphologicalchangesbetweenthecomparedgroups(Transmissionelectronmicroscope,TEM),A549cellviability(newCCK-8cellassayKit),A549cellsapoptosis(AnnexinV-FITC/PIdoublestainingflowcytometry)andtheexpressionofA549pulmonarysurfactantA(SP-A)(Westernblot).[Results]Transmissionelectronmicroscopecellmorphologyobservationdisplayed,infectiongroupA549celldam?agedobviously,cellqualityappearedemptybubbledegeneration,chromatinheightagglutination,visibleapoptosisbodies;experi?mentgroupcellpackagefilmstructurefull,nuclearfilmfull,nucleolusobviously,nuclearchromatinelectronicdensitylow,chroma?tinuniform,noapoptoticbodies;controlgroupA549cellstructurefull,membranesurfacemicro-fluffrich,nuclearfilmfull,nucle?arweekclearancestructurenormal,chromatinuniform;infectiongroupandcontrolgroupcompared,InfectiongroupA549cellsur?vivalsignificantlyreduced[(70.35±2.89)%and(97.37±2.07)%,n=3,P<0.01],apoptosisratesignificantlyincreased[(8.63%±0.16)%and(2.55±0.11)%,n=3,P<0.01],Intheinfectedgroup,PAcoulddamageA549cellsanddecreasetheamountofSP-Aex?pression(n=5,P<0.05).Intheexperimentgroup,theprotectiveeffectofhUCMSContheA549cellsafterinfectionmayincreasetheexpressionofSP-A(n=5,P<0.05);[Conclusions]HUCMSCinhibitstheinfectionofA549cellsapoptosisandprotectionofA549cellssecreteSP-A.【期刊名稱】《中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）》【年(卷),期】2017(038)006【總頁數(shù)】6頁(P842-847)【關(guān)鍵詞】人臍帶間充質(zhì)干細胞;人肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549);細胞凋亡;SP-A【作者】楊淑梅;鄭璇兒;楊浩鳴;盧春敏;賴衛(wèi)明;饒韻蓓;任竹瀟;楊杰【作者單位】511442;廣東省婦幼保健院新511442511442;廣東省511442511442511442511442【正文語種】中文【中圖分類】R722.13人肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolartypeIIepithelialc-Ⅱ）具有合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)（pulmonarysurfactant，PS）的功能，在維護新生兒氣道穩(wěn)定性方面起著重要的作用。人臍帶間充質(zhì)干細胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSC ）具有降低其全身及肺部炎癥，提高存活率的作用，也通過分泌抗菌肽具有廣譜的抗菌作用。醫(yī)院感染是新生兒重癥監(jiān)護病neonatalintensivecareuntNICU）23.3%～53.74%［1］，銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa ，PA）是醫(yī)院感染的最常見條件致病菌之一，由其引起的急性或慢性感染往往治療難度大，具有多種藥機制，是引起院內(nèi)獲得性肺炎多重耐藥革蘭陰性菌的代表。銅綠假單胞菌近年在新生兒呼吸道標(biāo)本的分離率高達86.3%，新生兒，尤其是早產(chǎn)兒，機械輔助通氣及住院時間長、免疫力低下，是銅綠假單胞菌感染的高危人群。本研究的目的研究感染對AT-Ⅱ凋亡的影響，以及hUCMSC 對此感染狀態(tài)下AT-Ⅱ的保護作用希望為新生兒醫(yī)院感染，找到新的治療方法，提供理論基礎(chǔ)。A549細胞（廣州萊德聯(lián)康生物有限公司）及hUCMSC（天津衛(wèi)凱生物有限公司）10%FBS37℃5%CO2飽和濕度的培70%～80%1×105624h驗。A54910-20代用于實驗，hUCMSC5-1024hPAATCC27853（衛(wèi)生部臨床檢驗中心）PBS0.5PBS將上述1：50003×104CFU/mL。H-600型透射電鏡（日本日立公司，×8000）6h2000r/min（r=10cm）5min1mLPBS2000r/min離心5min1mL2.5%二醛固定液，4℃保存；②固定：4℃，2.5%2h50～60nm、3%～色，透射電鏡觀察，拍片。CCK-8限公司，操作方法見參考文獻［2］。應(yīng)用AnnexinV-PI雙染法檢測細胞凋亡。將A549細胞以1×105個/mL接種于6孔板，37℃、體積分數(shù)5%CO2 條件下培養(yǎng)；按照上述分組處理相應(yīng)時間后操作方法見參考文獻［3］。采用Westernblot方法檢測。用12%SDSPAGE 進行凝膠電泳，然后在300恒流的條件下將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用8%的牛奶封閉2過夜孵一抗（SP-A），用抗體洗滌液（PBST）充分洗膜后，加入相應(yīng)的二抗（IgG-HRP）孵育2h。然后使用發(fā)光液，按照試劑說明，進行化學(xué)發(fā)光顯影。SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)計算，計量資料采用x±s,表示，對計量資料進用兩獨立樣本的秩和檢驗進行兩兩比較（Wilcoxon法），p＜0.01A549細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞膜表面微絨毛豐富，核膜完整，質(zhì)高度凝集，可見凋亡小體（1）；實驗組細胞包膜結(jié)構(gòu)A549細胞存活率，CCK-8細胞增殖法檢測結(jié)果提示感染組細胞存活率明顯降低［（70.35±（97.37±，n=3p＜0.01］；實驗組細胞存活率明顯增加［（85.69±3.07（70.35±2.89，n=3，p＜0.012］。通過流式細胞儀測定A549細胞凋亡率，感染組A549細胞凋亡率明顯增加［（8.63±0.16%與2.55±0.11%n=3p＜0.01］；實驗組細胞凋亡率明顯降低與，n=3，p＜0.01；圖3］。Westernblot對SP-A表達的檢測，感染組中，PA可能損傷A549細胞，使其SP-A表達量著減少（n=5，p＜0.05，圖4），實驗組中，hUCMSC 可能對感后A549細胞的保護作用，其SP-A表達量增加（n=5，p＜0.05，圖4）。A549細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮，凋亡小體形成；與對A549細胞細胞存活率顯著降低，凋亡率顯著增加，SP-A分泌降低。顯示細菌感染導(dǎo)致肺泡SP-A減少。本研究結(jié)果與之前研究結(jié)果一致［3］。本研究的這一結(jié)果，與臨床醫(yī)院感染肺炎（如呼吸機相關(guān)肺炎等）質(zhì)治療這些臨床表現(xiàn)相一致［4］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)實驗組（hUCMSC 組）細胞包膜結(jié)構(gòu)完整，核膜完整，核仁明顯，核染色質(zhì)電子密度低，染色質(zhì)均一，未見凋亡小體。從形態(tài)學(xué)證實了hUCMSC 可保護AT-II免受凋亡。同時，實驗組與感染組比較，細胞凋亡率有所下降，細胞存活率升高，說明人肺泡Ⅱ型上皮細胞在hUCMSC 作用下存活時間長。其可能增強人肺泡Ⅱ型上皮細胞的功能，促進PS的合成及分泌。關(guān)于間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcell，MSC）對炎性狀態(tài)下肺損傷的保護作用相關(guān)研究顯示：Gupta等［5］使用MSC治療大腸埃希菌內(nèi)毒素引起的急性肺損傷小鼠，其生存率得到顯著提高。Mei等［6］發(fā)現(xiàn)小鼠MSC能減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）致急性肺損傷小鼠的肺水腫程度，其作用機制是MSC1（angiopoietin促MSC能減輕內(nèi)毒素致離體人肺的炎癥損傷［7-10］。骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells ，BMMSC ）早期減輕急性肺損傷作用可能存在著多種機制，BMMSC 通過旁分泌機制調(diào)控肺泡上皮細胞凋亡是其中重要的機制之一。BMMSC 通過抑制肺泡上皮細胞凋亡，促進肺泡上皮細胞增生，減少肺泡上皮細胞的損傷，恢復(fù)上皮細胞功能，修復(fù)肺泡上細胞屏障，改善肺水腫，減輕肺損傷。BMMSC 可通過肺循環(huán)定植于肺受損部位，能不同程度地減輕肺部炎性反應(yīng)，提高生存率［11-12］MSC在損傷的肺組織中可以分化為AT-AT-］。這些研究均證實了MSC對于促進肺泡上皮細胞的分化與炎性損傷保護作用，但之前研究均為骨髓間充質(zhì)干細胞的研究，型上皮細胞保護作用的研究，仍未見報道。SP-A是最早被發(fā)現(xiàn)且在AT-Ⅱ中表達最強烈，信號最豐富的蛋白，是PS中最重要的蛋白成分。本研究中感染組SP-A的表達量減少，提示感染對SP-A的分泌有抑制作用；實驗組SP-A的表達量明顯增加，提示hUCMSC 對感染狀態(tài)下SP-A的分泌有一定的促進作用。相關(guān)研究證實，嚴重肺部感染、全身性炎癥反應(yīng)引起內(nèi)炎癥細胞聚集等，可直接或間接損傷AT-Ⅱ，干擾PS的合成和代謝，導(dǎo)致肺內(nèi)PS含量、組分和功能的改變，包括PS總量的減少，SP的減少或缺失，體外活性明顯降低［15-17］。本研究結(jié)果感染組SP-A的表達量減少，其可能的原因為感染對A549細胞的損傷，干擾PS的合成，從而導(dǎo)致SP-A的表達減少。研究發(fā)現(xiàn)對于LPS造成的肺損傷，hUCMSC 具有降低肺部炎癥，提高存活率，本研究實驗組SP-A的表達量增加，可能的原因為hUCMSC 對感染的抑制作用，對A549細胞的保護作用，從而促進SP-A的分泌，SP-A的表達量增加。呼吸道感染性疾病是導(dǎo)致新生兒死亡的重要疾病之一，據(jù)國內(nèi)學(xué)者報道早產(chǎn)兒的亡率高達12.7%～20.8%，其中細菌性感染是造成其死亡的重要原因［18］。目前關(guān)于hUCMSC 對感染狀態(tài)下人肺泡Ⅱ型上皮細胞（A549）保護作用的研究尚未見報道，本文通過分析hUCMSC 對感染狀態(tài)下人肺泡Ⅱ型上皮細胞（A549）凋亡的作用研究，具有一定的創(chuàng)新性，為新生兒呼吸道感染的防治提供新的思路方法。本研究結(jié)果提示hUCMSC 對感染狀態(tài)下人肺泡Ⅱ型上皮細胞（A549）的有保護作用，由此可推斷hUCMSC 可能對新生兒呼吸道感染性疾病具有保護作用從而為減少抗生素的濫用，為新生兒呼吸道感染性疾病提供新的方法，有望應(yīng)用于臨床。hUCMSC 來源廣泛，易于獲得，方便取材，對母體和嬰兒均無痛苦而且可以長期儲存，不受倫理道德方面的爭議，為其最終應(yīng)用于臨床治療感染疾病奠定礎(chǔ)，有望作為臨床抗生素的替代治療。【相關(guān)文獻】［1］學(xué)雜志，2017，27（8）：1785-1788.YinDP，HeDD，ZhangYQ，etal.StudyonthedistributioncharacteristicsofrelatedriskfactorsinhospitalncinJhosp，27（8）：1785-1788.［2］ChowdhurySR，SenguptaS，BiswasS，etal.Lowfucosecontainingbacterialpolysaccharidefacilitatemitochondria-dependentROS-inducedapoptosisofhumanepithelialcarcinomaviacontrolledregulationofMAPKs-mediatedNrf2/Keap1homeostasissignalingPharmacol，54（12）：1636-1655.［3］BougléA，F(xiàn)oucrierH，etal.ImpactofthedurationofantibioticsonclinicaleventsinpatientswithPseudomonasaeruginosaventilator-associatedStudyprotocolforarandomizedcontrolledstud［］.Trias2017，18（1）：37.［4］AhmedGF，ElkhatibWF，NoreddinAM.InhibitionofpseudomonasaeruginosaPAO1adhesiontoandinvasionofA549lungepithelialcellsbynaturalInfectPublicHealh2014，7（5）436-444.［5］GuptaN，SuX，PopovB，etal.Intrapulmonarydeliveryofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsimprovessurvivalandattenuatesendotoxin-inducedacutelunginjuryinmie］.JImmunol，2007，179（3）：1855-1863.［6］MeiSH，HaitsmaJJ，DosSantosCC，etal.MesenchymalstemcellsreduceinflammationwhileenhancingbacterialclearanceandimprovingsurvivalinJRespirCritCare，182（8）：1047-1057.［7］HerzmannN，SalamonA，F(xiàn)iedleral.Lipopolysaccharideinducesproliferationandosteogenicdifferentiationofadipose-derivedmesenchymalstromalcellsinvitroviaTLR4activatio［］.ExpCellRe，2017，350（1）：115-122.［8］FengLX，PengS，TianMI，etal.AgglutininisolatedfromArisemablumeinducesapoptosisandautophagyinA549cellsthroughinhibitingPI3K/AktpathwayandinducingERstressJNatMed，2016，14（11）：856-864.［9］GurunathanS，JeongJK，HanJW，etal.MultidimensionaleffectsofbiologicallysynthesizedsilvernanoparticlesinHelicobacterpyoelicobacterfelsandhumanlung（L132）andlungcarcinomaA549cellsRes，10（1）：35.［10］HaczkuA.ProtectiveroleofthelungcollectinssurfactantproteinAandsurfactantproteinDinairwayinflammatio［］.JAllergyClinImmuno，2008，1225）：861-879.［11］ChengX，WangB，Jinal.Pseudomonasaeruginosa-mannose-sensitivehemagglutinininhibitspancreaticcancercellproliferationandinducesapoptosisviaEGFRpathwayandcaspasesignaling［J］.Oncotarget，2016，7（47）：916-925.［12］HerzmannN，SalamonA，F(xiàn)iedleral.Analysisofmigrationrateandchemotaxisofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcellsinresponsetoLPSLTAinvito］.ExpCellRe，2016，342（2）：：95-103.［13］LiJW，WuX.MesenchymalstemcellsameliorateLPS-inducedacutelunginjurythroughKGFpromotingalveo