細菌的培養(yǎng)及鑒定

關于細菌的培養(yǎng)及鑒定第1頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五標本采集原則1.及時采集微生物標本作病原學檢查2.在抗菌藥物使用前采集標本3.采樣時嚴格執(zhí)行無菌操作4.標本容器須無菌，但不得有消毒劑5.采樣后立即送檢6.送檢標本應注明來源和檢驗目的第2頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五咳痰方法病人先漱口，清潔口腔，去除表面的菌群病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液無痰可用3％～5％NaCl5ml霧吸約5min導痰以清晨第二口痰為佳標本采集后放置時間不超過2小時

第3頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五清潔中段尿液盡量取早晨第一次尿液囑患者留取標本的前一天晚上少飲水女性病人收集標本前用肥皂水沖洗外陰，再以滅菌清水沖洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻轉包皮，清洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流,采集中段尿

采集標本后立即送檢！第4頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五哥倫比亞血平板—營養(yǎng)要求高的細菌巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍/麥康凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細菌用沙包氏平板—真菌培養(yǎng)用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用常用的培養(yǎng)基種類和用途第5頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五臨床標本培養(yǎng)基選擇血：血培養(yǎng)瓶中斷尿：血平板、mac平板腦脊液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板、mac平板膽汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麥康凱、SS、血平板第6頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五細菌接種的基本程序滅菌接種環(huán)沾取標本接種滅菌接種環(huán)第7頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五細菌接種法平板劃線接種法：

★目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。

★方法：★分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標本★連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標本第8頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五分區(qū)劃線法(3區(qū))第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第9頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五連續(xù)劃線法第10頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五細菌培養(yǎng)法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：★培養(yǎng)溫度：35℃（采用恒溫培養(yǎng)箱）★培養(yǎng)時間：18～24h二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等第11頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五細菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落★定義：指單個細菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細菌集團。★菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性★菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細菌堆積物。第12頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五菌落第13頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五菌落與菌苔第14頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五菌落的三個類型：

1.光滑型菌落（SmoothtypeColony）：又稱S型2.粗糙型菌落（RoughtypeColony）：又稱R型3.粘液型菌落（MucoidtypeColony）又稱M型第15頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五2022/11/1516S型菌落第16頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五R型菌落第17頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五M型菌落第18頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五革蘭染色原理：通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經復紅等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。第19頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五革蘭染色步驟

涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第20頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五固定的目的：使細菌的細胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固；可改變菌體對染料的通透性；加熱固定可殺死細菌，比較安全。第21頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五

結晶紫1’

碘液1’

95%乙醇

30”

復紅1’

沖洗濾紙干燥

油鏡觀察沖洗沖洗沖洗革蘭染色程序初染媒染脫色復染第22頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五紫色（G＋）革蘭氏染色步驟示意圖革蘭染色甲菌乙菌初染結晶紫媒染碘液脫色乙醇復染稀釋復紅紫色（G＋）紅色（G-）革蘭染色步驟示意圖第23頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五【結果】細菌被染成紫色者，稱為革蘭陽性菌；而細菌染成紅色者，稱為革蘭陰性菌；陽性菌——紫色（G+b)陰性菌——紅色（G-b)第24頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五G+球菌第25頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五顯微鏡下的桿菌G-桿菌Figure2-GramstainofGram-E.colicells第26頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五痰標本涂片染色低倍鏡下分類分級白細胞（個）上皮細胞（個）A>25<10B>25<25C<10>25A、B兩種情況的痰適合做培養(yǎng)，C不合格，應重新留標本第27頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五革蘭染色注意事項標本涂片不宜太厚固定不宜過熱脫色不宜過度選用培養(yǎng)18--24小時菌齡的細菌為宜第28頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五抗酸染色原理：分枝桿菌細胞壁含脂質較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時與石炭酸復紅結合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復紅的顏色,達到染色目的。第29頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五抗酸染色步驟

1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第30頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五抗酸染色步驟2、染色包括初染、脫色、復染三步。

石炭酸復紅維持3-5’

3%鹽酸酒精30’’

~1’

美藍復染1’

沖洗干燥

油鏡觀察沖洗沖洗初染脫色復染第31頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五抗酸染色結果抗酸菌呈紅色，常堆積成團，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細菌呈蘭色。第32頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五抗酸桿菌報告300個視野僅見到1—8條抗酸桿菌填寫條數(shù)1+：鏡檢查見3-9條抗酸桿菌/100高倍鏡視野2+：鏡檢查見1—9條抗酸桿菌/10高倍鏡視野3+：鏡檢查見1-9條抗酸桿菌/高倍鏡視野4+:鏡檢查見>9條抗酸桿菌/高倍鏡視野第33頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五抗酸染色注意事項染色充分脫色時間寧長勿短在涂抹痰標本時嚴禁對載玻片進行加熱第34頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五臨床標本培養(yǎng)基選擇生殖道標本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗項目接種相應的平板及操作：

淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板;念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通培養(yǎng)則接種血平板和巧克力平板

第35頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五觀察細菌在平板上的生長現(xiàn)象血平板：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性mac平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度巧克力平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度第36頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五2022/11/1537革蘭陰性菌葡萄球菌第37頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五細菌的初步分類細菌的分離與純化：自血平板挑出待檢菌株的單菌落進行初步的鑒定。如果混有雜菌，應該重新轉種分純。染色與鏡檢：首先通過革蘭氏染色確定基本的分類：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-桿菌（4）G+桿菌。此外，如果鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體，可能是真菌。第38頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五金黃色葡萄球菌最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明顯β溶血環(huán)，顏色呈金黃色、灰白色或檸檬色分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇血漿凝固酶和DNA酶陽性

第39頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五第40頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五2022/11/1541葡萄球菌第41頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五第42頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五第43頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五念珠菌顯色培養(yǎng)基

綠色—白色念珠菌藍色—熱帶念珠菌白色—其他，細菌被抑制紫色—光滑粉色—克柔假絲酵母菌第44頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五第45頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五第46頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五嗜血桿菌的鑒定途徑只能在營養(yǎng)條件高的巧克力平板上生長，菌落為中等大小、圓形、灰白色、透明革蘭染色：G-小桿菌衛(wèi)星實驗就可以幫助初步鑒定第47頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五2022/11/1548嗜血桿菌第48頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五奈瑟氏菌屬鑒定在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圓形、灰藍色的似露滴狀菌落革蘭染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆形，凹面相對氧化酶和觸酶都均為陽性第49頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五

奈瑟氏菌屬有11個種，臨床就淋病奈

菌和腦膜炎奈瑟菌最為重要第50頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五奈瑟氏菌屬鑒定流程

菌落觀察：灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血

涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆狀

氧化酶試驗+觸酶+

+麥芽糖--

腦膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌第51頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五細菌的鑒定與藥敏第52頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五衛(wèi)生部重點監(jiān)控的6種MDRO

MASA:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌—判斷標準：對苯唑西林耐藥或頭孢西丁誘導實驗陽性CRAB：耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌—判斷標準：對亞胺培南或美羅培南耐藥

VER：耐萬古霉素腸球菌—判斷標準：對萬古霉素耐藥第53頁，共59頁，2022年，5月20日，23點42分，星期五ESBLs：產超廣譜β內酰胺酶細菌。包