新型KRAB型鋅指蛋白ZNF569對MAPK信號通路的抑制作用課件

新型KRAB型鋅指蛋白ZNF569對MAPK信號通路的抑制作用新型KRAB型鋅指蛋白ZNF569對MAPK信號通路的抑制作1背景C2H2型鋅指蛋白（KRAB-ZFP）是預(yù)測轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的最大家族中的成員。其結(jié)構(gòu)特征是無指結(jié)構(gòu)域的前后兩鋅指結(jié)構(gòu)之間存在一連接序列”TGEKPYX”（H-Clink）。ZNF569編碼一個由686個氨基酸組成的預(yù)測蛋白。該蛋白質(zhì)在進(jìn)化中是高度保守的。細(xì)胞中ZNF569的過表達(dá)會抑制SRE(血清反應(yīng)元件)和AP-1（激活蛋白-1）的轉(zhuǎn)錄活性，而由siRNA引起的ZNF569的失活會使這種抑制作用喪失。背景C2H2型鋅指蛋白（KRAB-ZFP）是預(yù)測轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子2AP-1復(fù)合體是由轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的二聚體,可以被磷酸化的MAPK迅速的激活。MAPK家族是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，轉(zhuǎn)錄因子可以通過激活MAPKs中ERK（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶）亞家族誘導(dǎo)AP-1。MAPKs通過與SRE（即血清反應(yīng)元件）結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄立即早期基因的表達(dá)。KRAB和ZNF基序是ZNF569的有效抑制結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，ZNF569可能是MAPK信號通路中一種新型的抑制劑。AP-1復(fù)合體是由轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的二聚體,可以被磷酸化的MAP3材料與方法ZNF569的鑒別和序列分析（全長cDNA克隆與生物信息學(xué)分析）人類成體和胚胎的ZNF569表達(dá)的Northern分析瞬時轉(zhuǎn)染及亞細(xì)胞定位分析瞬時表達(dá)報告基因含量檢測RNA干擾分析缺失分析

材料與方法4

運(yùn)用BLAST程序利用KRAB中的共有序列尋找人類EST數(shù)據(jù)庫。

以心臟cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR↓瓊脂糖凝膠電泳形成條帶↓條帶克隆入pMD18T-vector↓隨機(jī)克隆↓對獲得序列進(jìn)行同源性檢索運(yùn)用BLAST程序利用KRAB中的共有序列尋找人5

確認(rèn)EST數(shù)據(jù)庫中的cDNA序列用于5’RACE擴(kuò)增ZNF569確認(rèn)EST數(shù)據(jù)庫中的cDNA序列用于5’RACE擴(kuò)增ZNF6ZNF569的cDNA全長為2061bpKRAB結(jié)構(gòu)域18個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)

ZNF569的cDNA全長為2061bpKRAB結(jié)構(gòu)域187ZNF569的基因組定位和基因組結(jié)構(gòu)。外顯子用紅色框來表示新型KRAB型鋅指蛋白ZNF569對MAPK信號通路的抑制作用課件8ZNF569基因的外顯子和內(nèi)含子的長度及剪切位點(diǎn)。不變的核苷酸(gt/ag)用粗體鉛字強(qiáng)調(diào)。ZNF569基因的外顯子和內(nèi)含子的長度及剪切位點(diǎn)。9成人組織25周胚胎P32標(biāo)記的ZNF569cDNA探針

Northernblot

多組織膜雜交

膜形成條帶狀并用作為mRNA含量指示劑的放射性標(biāo)記的β-肌動蛋白cDNA進(jìn)行檢測成人組織10對人類成體和胚胎組織ZNF569的Northernblot分析成體胚胎對人類成體和胚胎組織ZNF569的Northernblot11COS-7細(xì)胞中ZNF569蛋白的亞細(xì)胞定位。

圖A表示EGFP-ZNF569在COS-7細(xì)胞中表達(dá)；圖B表示細(xì)胞核用DAPI染色；圖C是當(dāng)ZNF569過表達(dá)時，ZNF569在COS-7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位(圖A和圖B形成的結(jié)合圖)。

EGFP-ZNF569定位在COS-7細(xì)胞的細(xì)胞核中COS-7細(xì)胞中ZNF569蛋白的亞細(xì)胞定位。

圖A表示EG12pCMV-BD–ZNF569或pCMV-BD與pL8G5-Lucreporter和pLexA-VP16短暫地共轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。

pCMV-BD–ZNF569或pCMV-BD與pL8G5-L13ZNF569的過表達(dá)解除其對AP-1-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用

ZNF569的過表達(dá)解除其對AP-1-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作14ZNF569的過表達(dá)會解除其對SRE-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用ZNF569的過表達(dá)會解除其對SRE-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作15總結(jié)ZNF569是一種新型的KRAB型鋅指蛋白,從人類胚胎心臟cDNA文庫中分離出來.它在不同種群的進(jìn)化過程中是高度保守的。ZNF569是一種轉(zhuǎn)錄抑制物。KRAB和ZNF結(jié)構(gòu)是ZNF569的有效抑制結(jié)構(gòu)域。當(dāng)ZNF569與Gal-4的DNA結(jié)合域結(jié)合，并與VP-16發(fā)生共轉(zhuǎn)染時，ZNF569就會抑制SRE和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。ZNF569過表達(dá)會解除其對SRE和AP-1轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，原因可能是siRNA的存在。

ZNF569可能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子通過抑制MAPK信號通路來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能

總結(jié)ZNF569是一種新型的KRAB型鋅指蛋白,從人類胚胎心16KRAB是一種在進(jìn)化上相較于鋅指重復(fù)序列更保守的蛋白結(jié)構(gòu)域。對ZNF569中KRAB結(jié)構(gòu)域序列的分析顯示，與其他鋅指蛋白相比，KRAB結(jié)構(gòu)域有高度的同源性。ZNF569可能通過KRAB結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域與其他轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)子結(jié)合，從而形成哺乳動物介導(dǎo)復(fù)合物。關(guān)于這種新型轉(zhuǎn)錄抑制物的詳細(xì)結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

KRAB是一種在進(jìn)化上相較于鋅指重復(fù)序列更保守的蛋白結(jié)構(gòu)域17ThinkYou！ThinkYou！18新型KRAB型鋅指蛋白ZNF569對MAPK信號通路的抑制作用新型KRAB型鋅指蛋白ZNF569對MAPK信號通路的抑制作19背景C2H2型鋅指蛋白（KRAB-ZFP）是預(yù)測轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的最大家族中的成員。其結(jié)構(gòu)特征是無指結(jié)構(gòu)域的前后兩鋅指結(jié)構(gòu)之間存在一連接序列”TGEKPYX”（H-Clink）。ZNF569編碼一個由686個氨基酸組成的預(yù)測蛋白。該蛋白質(zhì)在進(jìn)化中是高度保守的。細(xì)胞中ZNF569的過表達(dá)會抑制SRE(血清反應(yīng)元件)和AP-1（激活蛋白-1）的轉(zhuǎn)錄活性，而由siRNA引起的ZNF569的失活會使這種抑制作用喪失。背景C2H2型鋅指蛋白（KRAB-ZFP）是預(yù)測轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子20AP-1復(fù)合體是由轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的二聚體,可以被磷酸化的MAPK迅速的激活。MAPK家族是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，轉(zhuǎn)錄因子可以通過激活MAPKs中ERK（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶）亞家族誘導(dǎo)AP-1。MAPKs通過與SRE（即血清反應(yīng)元件）結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄立即早期基因的表達(dá)。KRAB和ZNF基序是ZNF569的有效抑制結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，ZNF569可能是MAPK信號通路中一種新型的抑制劑。AP-1復(fù)合體是由轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的二聚體,可以被磷酸化的MAP21材料與方法ZNF569的鑒別和序列分析（全長cDNA克隆與生物信息學(xué)分析）人類成體和胚胎的ZNF569表達(dá)的Northern分析瞬時轉(zhuǎn)染及亞細(xì)胞定位分析瞬時表達(dá)報告基因含量檢測RNA干擾分析缺失分析

材料與方法22

運(yùn)用BLAST程序利用KRAB中的共有序列尋找人類EST數(shù)據(jù)庫。

以心臟cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR↓瓊脂糖凝膠電泳形成條帶↓條帶克隆入pMD18T-vector↓隨機(jī)克隆↓對獲得序列進(jìn)行同源性檢索運(yùn)用BLAST程序利用KRAB中的共有序列尋找人23

確認(rèn)EST數(shù)據(jù)庫中的cDNA序列用于5’RACE擴(kuò)增ZNF569確認(rèn)EST數(shù)據(jù)庫中的cDNA序列用于5’RACE擴(kuò)增ZNF24ZNF569的cDNA全長為2061bpKRAB結(jié)構(gòu)域18個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)

ZNF569的cDNA全長為2061bpKRAB結(jié)構(gòu)域1825ZNF569的基因組定位和基因組結(jié)構(gòu)。外顯子用紅色框來表示新型KRAB型鋅指蛋白ZNF569對MAPK信號通路的抑制作用課件26ZNF569基因的外顯子和內(nèi)含子的長度及剪切位點(diǎn)。不變的核苷酸(gt/ag)用粗體鉛字強(qiáng)調(diào)。ZNF569基因的外顯子和內(nèi)含子的長度及剪切位點(diǎn)。27成人組織25周胚胎P32標(biāo)記的ZNF569cDNA探針

Northernblot

多組織膜雜交

膜形成條帶狀并用作為mRNA含量指示劑的放射性標(biāo)記的β-肌動蛋白cDNA進(jìn)行檢測成人組織28對人類成體和胚胎組織ZNF569的Northernblot分析成體胚胎對人類成體和胚胎組織ZNF569的Northernblot29COS-7細(xì)胞中ZNF569蛋白的亞細(xì)胞定位。

圖A表示EGFP-ZNF569在COS-7細(xì)胞中表達(dá)；圖B表示細(xì)胞核用DAPI染色；圖C是當(dāng)ZNF569過表達(dá)時，ZNF569在COS-7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位(圖A和圖B形成的結(jié)合圖)。

EGFP-ZNF569定位在COS-7細(xì)胞的細(xì)胞核中COS-7細(xì)胞中ZNF569蛋白的亞細(xì)胞定位。

圖A表示EG30pCMV-BD–ZNF569或pCMV-BD與pL8G5-Lucreporter和pLexA-VP16短暫地共轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。

pCMV-BD–ZNF569或pCMV-BD與pL8G5-L31ZNF569的過表達(dá)解除其對AP-1-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用

ZNF569的過表達(dá)解除其對AP-1-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作32ZNF569的過表達(dá)會解除其對SRE-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用ZNF569的過表達(dá)會解除其對SRE-Luc轉(zhuǎn)錄活性的抑制作33總結(jié)ZNF569是一種新型的KRAB型鋅指蛋白,從人類胚胎心臟cDNA文庫中分離出來.它在不同種群的進(jìn)化過程中是高度保守的。ZNF569是一種轉(zhuǎn)錄抑制物。KRAB和ZNF結(jié)構(gòu)是ZNF569的有效抑制結(jié)構(gòu)域。當(dāng)ZNF569與Gal-4的DNA結(jié)合域結(jié)合，并與VP-16發(fā)生共轉(zhuǎn)染時，ZNF569就會抑制SRE和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。ZNF569過表達(dá)會解除其對SRE和AP-1轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，原因可能是siRNA的存在。

ZNF569可能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子通過抑制MAPK信號通路來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能

總結(jié)ZNF569是一種新型的KRAB型