重組腺相關病毒rAAV在神經(jīng)科學中的應用課件

重組腺相關病毒rAAV中科院神經(jīng)所病毒平臺2017年1月重組腺相關病毒rAAV中科院神經(jīng)所病毒平臺1腺相關病毒（rAAV）簡介腺相關病毒、細小病毒科無包膜單鏈DNA病毒，基因組長約4.7-6kb是迄今發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，通常需要在輔助病毒的輔助下才能發(fā)生產(chǎn)毒性感染，生成子代AAV腺相關病毒（rAAV）簡介腺相關病毒、細小病毒科2AAV的基因組及其編碼的蛋白AAV病毒顆粒示意圖；B：AAV病毒基因組結(jié)構(gòu)（KottermanMAetal.NatRevGenet.2014.）AAV的基因組及其編碼的蛋白AAV病毒顆粒示意圖；B：AA3病毒載體選擇指南

AdenovirusAdeno-associated

Virus(AAV)Lentivirus基因組dsDNAssDNAssRNA(+)包膜無無有基因組大小38-39kb5kb9kb細胞感染分裂細胞和非分裂細胞分裂細胞和非分裂細胞分裂細胞和非分裂細胞整合機制非整合定向整合整合持續(xù)時間<10天>3個月>2個月包裝能力7.5kb4.5kb6kb免疫原性強弱一般滴度10^11-12vg/mL10^12-13vg/mL10^8-9vg/mL轉(zhuǎn)導效率100%70%70%病毒載體選擇指南AdenovirusAdeno-asso4AAV載體的優(yōu)勢與局限優(yōu)勢安全性高無致病性、不整合、低免疫原性表達時程長＞5個月高效穩(wěn)定表達嗜性廣分裂及非分裂細胞（神經(jīng)元）、多種血清型實現(xiàn)不同靶向局限外源基因容載能力有限＜4.7Kb通用啟動子高表達外源基因的毒性AAV載體的優(yōu)勢與局限優(yōu)勢局限5rAAV三質(zhì)粒制備系統(tǒng)

A：rAAV載體原理（KottermanMAetal.NatRevGenet.2014.）；B：制備rAAV的三質(zhì)粒系統(tǒng)示意圖（AyusoEetal.CurrGeneTher.2010.）rAAV三質(zhì)粒制備系統(tǒng)A：rAAV載體原理（Kot6傳統(tǒng)三質(zhì)粒制備AAV系統(tǒng)的缺陷生產(chǎn)能力低103-104vg/cel難滿足靈長類研究及臨床需求病毒質(zhì)量不穩(wěn)定多批次包裝條件不均一純化過程導致的空殼率不可控傳統(tǒng)三質(zhì)粒制備AAV系統(tǒng)的缺陷生產(chǎn)能力低7

新型rAAV桿狀病毒制備系統(tǒng)桿狀病毒系統(tǒng)制備rAAV的流程圖新型rAAV桿狀病毒制備系統(tǒng)桿狀病毒系統(tǒng)制備rAAV的流程8新型AAV桿狀病毒制備體系的優(yōu)勢靈活性高、通用性強、病毒質(zhì)量高、產(chǎn)量高，適于大規(guī)模放大生產(chǎn)，rAAV純化后能夠達到很高的純度，可有效解決非人靈長類動物神經(jīng)環(huán)路標記的大量需求。

純化后的rAAV病毒經(jīng)過掃描電鏡檢測，完整的rAAV顆粒比例大于85%，病毒質(zhì)量高。純化后的rAAV處理后進行SDS凝膠電泳考馬斯亮藍染色檢測，可以觀察到明顯的病毒粒子衣殼蛋白VP1，VP2，VP3所對應的1:1:10比例組成的三種蛋白，分子量與預期一致，純度高于95%。新型AAV桿狀病毒制備體系的優(yōu)勢靈活性高、通用性強、病毒質(zhì)量9AAV的血清型與其對細胞組織的轉(zhuǎn)導特性不同血清型AAV對小鼠組織細胞的嗜性差異很大（KarenKozarskyetal.NatMethods.2010.）AAV的血清型與其對細胞組織的轉(zhuǎn)導特性不同血清型AAV對小鼠10rAAV的應用-視網(wǎng)膜內(nèi)界膜細胞的感染在內(nèi)界膜注射rAAV2-CBA-GFP，病毒感染效果圖。A：在注射部位，大部分的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞病毒表達水平都很高；B:視網(wǎng)膜muller細胞和雙極細胞均檢測到信號（BoyeSEetal.HumGeneTher.2016）rAAV的應用-視網(wǎng)膜內(nèi)界膜細胞的感染在內(nèi)界膜注射rAAV11rAAV在肝臟纖維化研究中的應用rAAVX-EYFP感染肌成纖維細胞效果圖（RezvaniMetal.CellStemCell.2016.）rAAV在肝臟纖維化研究中的應用rAAVX-EYFP感染肌成12rAAV的應用-腦中樞神經(jīng)元的感染rAAV-GFP注射海馬感染效果圖（BroekmanMLetal.Neuroscience.2006.）rAAV的應用-腦中樞神經(jīng)元的感染rAAV-GFP注射海馬感13rAAV的應用-神經(jīng)元投射研究rAAV注射紅核區(qū)，分別在7d和30d觀察轉(zhuǎn)導效率和感染RN細胞的特異性（BlitsBetal.JNeurosciMethods.2010.）rAAV的應用-神經(jīng)元投射研究rAAV注射紅核區(qū)，分別在714rAAV的應用-心臟心肌細胞的感染不同血清型不同滴度的rAAV病毒感染心肌細胞（PrasadKMetal.GeneTherapy.2011.）rAAV的應用-心臟心肌細胞的感染不同血清型不同滴度的rA15rAAV的應用-骨骼肌細胞感染AAV-lacZ注射肌細胞，原位雜交檢測病毒的表達量（KesslerPDetal.PNAS.1996.）rAAV的應用-骨骼肌細胞感染AAV-lacZ注射肌細胞，原16rAAV的應用-肺部細胞的感染在CMV和RSV啟動子調(diào)控下AP在肺部的表達情況（HalbertCLetal.HumGeneTher.2007.）rAAV的應用-肺部細胞的感染在CMV和RSV啟動子調(diào)控下A17rAAV的應用-神經(jīng)示蹤圖a.利用狂犬病毒系統(tǒng)逆向追蹤小鼠背外側(cè)被蓋區(qū)（LDT）中PV陽性和SOM陽性中間神經(jīng)元的直接調(diào)控網(wǎng)絡示意圖；圖b.LDT中PV陽性和SOM陽性中間神經(jīng)元都接受來自外側(cè)僵核（LHb）的直接調(diào)控(YangHetal.NatNeurosci.2016.）rAAV的應用-神經(jīng)示蹤圖a.利用狂犬病毒系統(tǒng)逆向追蹤小鼠背18rAAV的應用-神經(jīng)示蹤利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨單突觸系統(tǒng)研究杏仁核基底外側(cè)核后部至腹側(cè)海馬CA1區(qū)之間存在豐富的谷氨酸能興奮性單突觸輸入（YangYetal.NatCommun.2016.）rAAV的應用-神經(jīng)示蹤利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨單突觸19重組腺相關病毒rAAV中科院神經(jīng)所病毒平臺2017年1月重組腺相關病毒rAAV中科院神經(jīng)所病毒平臺20腺相關病毒（rAAV）簡介腺相關病毒、細小病毒科無包膜單鏈DNA病毒，基因組長約4.7-6kb是迄今發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，通常需要在輔助病毒的輔助下才能發(fā)生產(chǎn)毒性感染，生成子代AAV腺相關病毒（rAAV）簡介腺相關病毒、細小病毒科21AAV的基因組及其編碼的蛋白AAV病毒顆粒示意圖；B：AAV病毒基因組結(jié)構(gòu)（KottermanMAetal.NatRevGenet.2014.）AAV的基因組及其編碼的蛋白AAV病毒顆粒示意圖；B：AA22病毒載體選擇指南

AdenovirusAdeno-associated

Virus(AAV)Lentivirus基因組dsDNAssDNAssRNA(+)包膜無無有基因組大小38-39kb5kb9kb細胞感染分裂細胞和非分裂細胞分裂細胞和非分裂細胞分裂細胞和非分裂細胞整合機制非整合定向整合整合持續(xù)時間<10天>3個月>2個月包裝能力7.5kb4.5kb6kb免疫原性強弱一般滴度10^11-12vg/mL10^12-13vg/mL10^8-9vg/mL轉(zhuǎn)導效率100%70%70%病毒載體選擇指南AdenovirusAdeno-asso23AAV載體的優(yōu)勢與局限優(yōu)勢安全性高無致病性、不整合、低免疫原性表達時程長＞5個月高效穩(wěn)定表達嗜性廣分裂及非分裂細胞（神經(jīng)元）、多種血清型實現(xiàn)不同靶向局限外源基因容載能力有限＜4.7Kb通用啟動子高表達外源基因的毒性AAV載體的優(yōu)勢與局限優(yōu)勢局限24rAAV三質(zhì)粒制備系統(tǒng)

A：rAAV載體原理（KottermanMAetal.NatRevGenet.2014.）；B：制備rAAV的三質(zhì)粒系統(tǒng)示意圖（AyusoEetal.CurrGeneTher.2010.）rAAV三質(zhì)粒制備系統(tǒng)A：rAAV載體原理（Kot25傳統(tǒng)三質(zhì)粒制備AAV系統(tǒng)的缺陷生產(chǎn)能力低103-104vg/cel難滿足靈長類研究及臨床需求病毒質(zhì)量不穩(wěn)定多批次包裝條件不均一純化過程導致的空殼率不可控傳統(tǒng)三質(zhì)粒制備AAV系統(tǒng)的缺陷生產(chǎn)能力低26

新型rAAV桿狀病毒制備系統(tǒng)桿狀病毒系統(tǒng)制備rAAV的流程圖新型rAAV桿狀病毒制備系統(tǒng)桿狀病毒系統(tǒng)制備rAAV的流程27新型AAV桿狀病毒制備體系的優(yōu)勢靈活性高、通用性強、病毒質(zhì)量高、產(chǎn)量高，適于大規(guī)模放大生產(chǎn)，rAAV純化后能夠達到很高的純度，可有效解決非人靈長類動物神經(jīng)環(huán)路標記的大量需求。

純化后的rAAV病毒經(jīng)過掃描電鏡檢測，完整的rAAV顆粒比例大于85%，病毒質(zhì)量高。純化后的rAAV處理后進行SDS凝膠電泳考馬斯亮藍染色檢測，可以觀察到明顯的病毒粒子衣殼蛋白VP1，VP2，VP3所對應的1:1:10比例組成的三種蛋白，分子量與預期一致，純度高于95%。新型AAV桿狀病毒制備體系的優(yōu)勢靈活性高、通用性強、病毒質(zhì)量28AAV的血清型與其對細胞組織的轉(zhuǎn)導特性不同血清型AAV對小鼠組織細胞的嗜性差異很大（KarenKozarskyetal.NatMethods.2010.）AAV的血清型與其對細胞組織的轉(zhuǎn)導特性不同血清型AAV對小鼠29rAAV的應用-視網(wǎng)膜內(nèi)界膜細胞的感染在內(nèi)界膜注射rAAV2-CBA-GFP，病毒感染效果圖。A：在注射部位，大部分的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞病毒表達水平都很高；B:視網(wǎng)膜muller細胞和雙極細胞均檢測到信號（BoyeSEetal.HumGeneTher.2016）rAAV的應用-視網(wǎng)膜內(nèi)界膜細胞的感染在內(nèi)界膜注射rAAV30rAAV在肝臟纖維化研究中的應用rAAVX-EYFP感染肌成纖維細胞效果圖（RezvaniMetal.CellStemCell.2016.）rAAV在肝臟纖維化研究中的應用rAAVX-EYFP感染肌成31rAAV的應用-腦中樞神經(jīng)元的感染rAAV-GFP注射海馬感染效果圖（BroekmanMLetal.Neuroscience.2006.）rAAV的應用-腦中樞神經(jīng)元的感染rAAV-GFP注射海馬感32rAAV的應用-神經(jīng)元投射研究rAAV注射紅核區(qū)，分別在7d和30d觀察轉(zhuǎn)導效率和感染RN細胞的特異性（BlitsBetal.JNeurosciMethods.2010.）rAAV的應用-神經(jīng)元投射研究rAAV注射紅核區(qū)，分別在733rAAV的應用-心臟心肌細胞的感染不同血清型不同滴度的rAAV病毒感染心肌細胞（PrasadKMetal.GeneTherapy.2011.）rAAV的應用-心臟心肌細胞的感染不同血清型不同滴度的rA34rAAV的應用-骨骼肌細胞感染AAV-lacZ注射肌細胞，原位雜交檢測病毒的表達量（KesslerPDetal.PNAS.1996.）rAAV的應用-骨骼肌細胞感染AAV-lacZ注射肌細胞，原35rAAV的應用-肺部細胞的感染在CMV和RSV啟動子調(diào)控下AP在肺部的表達情況（HalbertCLetal.HumGeneTher.2007.）rAAV的應用-肺部細胞的感染在CMV和RSV啟動子調(diào)控下A36rAAV的應用-神經(jīng)示蹤圖a.利用狂犬病毒系統(tǒng)逆向追蹤小鼠背外側(cè)被蓋區(qū)（LDT）中PV陽性和SOM陽性中