干旱脅迫對(duì)植物生理生化指標(biāo)的影響

干旱脅迫對(duì)植物生理生化指標(biāo)的影響摘要：水是生命之源，地球上任何生物的生存都離不開(kāi)水。并且，很多生物在出現(xiàn)缺水時(shí)都表現(xiàn)出一系列相應(yīng)的癥狀，特別是植物最明顯。植物常常遭受的有害影響因素之一就是缺水，當(dāng)植物消耗的水分無(wú)法從外界得到補(bǔ)充時(shí)，就會(huì)使植物體內(nèi)的一些生理生化指標(biāo)發(fā)生變化，如脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)等的含量。實(shí)驗(yàn)通過(guò)分光光度計(jì)分別在不同的波長(zhǎng)中測(cè)出吸光率，間接計(jì)算出其含量，我們通過(guò)測(cè)定這些指標(biāo)含量的變化就可以知道干旱對(duì)植物的損傷有多嚴(yán)重。植物經(jīng)常遭受干旱脅迫的危害，全世界干旱、半干旱地區(qū)的面積占總面積的43%，而中國(guó)更為嚴(yán)重，約占51.9%，因而研究植物的抗旱性尤為重要。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，當(dāng)小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫時(shí)，小麥幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(HQ、多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)的含量均升高。關(guān)鍵詞：干旱、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(Hg)、多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)引言1.1干旱及干旱對(duì)植物的影響干旱化已成為世界性的問(wèn)題，中國(guó)干旱半干旱地區(qū)面積為256.6X104km2,占國(guó)土面積的26.73%。在我國(guó)各干旱省份中，云南又屬于干旱的省份之一。對(duì)植物影響的諸多自然因素中，干旱占首位。因此研究干旱對(duì)植物的影響就尤為重要，以利于應(yīng)用于農(nóng)作物上。在農(nóng)業(yè)上可以采取植物的各種抗旱機(jī)制來(lái)抵抗干旱對(duì)農(nóng)作物的損傷，才不致使莊稼減產(chǎn)，利于豐收。那么，究竟什么算干旱呢？就讓我們來(lái)看看它的定義吧！當(dāng)植物耗水大于吸水時(shí)，就會(huì)使組織內(nèi)水分虧損，簡(jiǎn)而言之，過(guò)度水分虧缺的現(xiàn)象，稱為干旱。干旱可分為大氣干旱和土壤干旱。土壤干旱時(shí)，植物生長(zhǎng)困難或完全停止，受害情況比大氣嚴(yán)重。我國(guó)農(nóng)業(yè)每年受旱災(zāi)面積達(dá)2500多萬(wàn)km2。[1]水分在植物的生命活動(dòng)中起著極大的作用，全世界由于水分虧缺導(dǎo)致的減產(chǎn)超過(guò)其他因素造成的減產(chǎn)的總和⑵。大多數(shù)植物遭受干旱逆境后各個(gè)生理過(guò)程都會(huì)受到不同程度的影響。隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，植物可吸收的水分越來(lái)越少。因此，植物的一些生理生化指標(biāo)都發(fā)生了一定程度的變化。1.2實(shí)驗(yàn)的目的及意義希望可以通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)讓我們掌握干旱脅迫下植物的一些生理生化指標(biāo)的測(cè)定方法，并且通過(guò)測(cè)定這些指標(biāo)含量的變化來(lái)了解干旱對(duì)植物的傷害有多嚴(yán)重,及干旱脅迫對(duì)植物的傷害原因及研究其抗旱機(jī)理。當(dāng)知道植物的抗旱機(jī)制后我們就可以利用其抗旱機(jī)制，采取相應(yīng)的措施來(lái)保護(hù)植物了，特別是一些農(nóng)作物和一些景觀植物。材料與方法2.1材料植物材料：小麥種子、玉米種子；主要試劑：0.1%HgCl2，TTC，3%磺基水楊酸(SSA)，冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8)，0.6%TBA(用0.6%TCA配制)，PBS(pH=6.8，內(nèi)含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2［用20%(v/v)H2SO4配制］，PBS,(pH=5.8,內(nèi)含0.1mmol/LEDTA,1%PVP),POD反應(yīng)混合液(10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解),PPO反應(yīng)混合液(20mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解)5%三氯乙酸，PBS(pH=7.7),4mMDTNB(用0.1MpH=6.8PBS現(xiàn)配)。主要儀器：分光光度儀，離心機(jī)，試管，微量加樣器，研缽等。2.2實(shí)驗(yàn)種子的處理：品種為晴3或魯玉13的玉米種子或小麥種子(購(gòu)于西山種子公司)T用0.1%HgCl2消毒10min后T用蒸餾水漂洗干凈T用蒸餾水于26C下吸漲12hT播于墊有6層濕潤(rùn)濾紙的帶蓋白磁盤(24cmX16cm)中T于26^下暗萌發(fā)60hT計(jì)算發(fā)芽率(注意與前面結(jié)果比較)T選取長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗做干旱5天、高溫、鹽漬或低溫下處理（去除較矮或較高的玉米幼苗）。種子發(fā)芽率的測(cè)定：各取50粒吸脹的玉米種子或小麥種子T沿胚的中心線切成兩半（嚴(yán)格區(qū)分兩個(gè)半粒），進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：其中50個(gè)半粒進(jìn)行TTC染色（30r水浴20min）,取50個(gè)半粒進(jìn)行曙紅染色（室溫染色10min）T洗凈后觀察。根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計(jì)算發(fā)芽率。2.3實(shí)驗(yàn)方法及步驟（1）、脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定Pro的提取:分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的幼苗―加入3mL3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂T充分研磨―用2mL3%SSA洗研缽T5000rpm離心10minT量上清液體積。測(cè)定：上清液各2mLT分別加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮試劑T煮沸15minT冷卻后T5000rpm離心10min（若沒(méi)沉淀可略此步驟）T分別測(cè)定A520計(jì)算：Procontent=————xx—（）irrioLg'1FW）exLxJV■用（2）、丙二醛（MDA）含量的測(cè)定MDA提取：分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組-加入3mL10%TCA和少許石英砂T充分研磨―用2mL10%TCA洗研缽T5000rpm離心10minT量上清液體積。測(cè)定：分別取上清液各2mL―加入0.5%TBA（用10%TCA配制）2mLT煮沸15minT冷卻后T5000rpm離心5min（視沉淀有無(wú)）T分別測(cè)定OD傾和OD^。計(jì)算：OD^=C1X85.4OD532二C1X7.4+155000XC2解得：C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/(mmol/L)=6.45OD532-0.56OD450(式中，^為可溶性糖濃度，C2為MDA的濃度。)過(guò)氧化氫(即2)含量的測(cè)定H2O2提?。悍謩e取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組-加入3mL0.3%三氯乙酸(TCA)和少許石英砂T充分研磨―用2mLTCA洗研缽T5000rpm離心10minT量上清液體積。測(cè)定：分別取上清液各4mL-加入0.1%Ti(SO4)2［用20%(v/v)々SO’配制］0.2mLT搖勻TOD410計(jì)算：H2O2content=—――—xx—(pmol.g-1FW)exExJFJ、多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)含量的測(cè)定POD測(cè)定：取、多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)含量的測(cè)定POD測(cè)定：取POD反應(yīng)混合液(10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5mmol/LHg,用PBS溶解)3ml,加入酶液50口l(空白調(diào)零用提取液取代)，立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)0.5和1.5min時(shí)的A470OPPO測(cè)定：取PPO反應(yīng)混合液(20mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解)3ml,加入酶液0.1ml(空白調(diào)零用提取液取代)，立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)0.5和1.5min時(shí)的A%。?？寡趸傅奶崛。悍謩e取0.1g實(shí)驗(yàn)材料―加入少許石英砂和3ml提取液(50mmol/LPBS,pH6.0,內(nèi)含0.1mmol/LEDTA,1%PVP)T充分研磨T轉(zhuǎn)入離心管中T用2ml提取液洗研缽―5000rpm離心10minT量上清液體積T用于測(cè)定POD和PPO酶活性或分裝后轉(zhuǎn)至-20或-80C保存。以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個(gè)活力單位(U),則:A470TrVhPODactivities=x—(|.imoLg'1FWmin-1)exWxt險(xiǎn)^410礦息PPOactivities=x——(U.q'1FW)(lOlxWxt猊、谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定GSH的提取:分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的幼苗―加入3mL3%三氯乙酸(TCA)和少許石英砂T充分研磨―用2mL3%TCA洗研缽―5000rpm離心10minT量上清液體積。測(cè)定：上清液各2mL(空白用3%三氯乙酸代替)T分別加入0.4mL1MNaOHT1mL2mMDTNBT25°c5minT測(cè)定A412計(jì)算：GSHcontent=————x^x—(|iiTiol.g'1FW)ex￡x卬7■用實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：發(fā)芽率的測(cè)定：小麥:TTC染色法：48個(gè)具有活力，因此其發(fā)芽率為：48/50X100%=96%；曙紅染色法：50個(gè)具有活力，因此其發(fā)芽率為：50/50X100%=100%。玉米：TTC染色法：45個(gè)具有活力，因此其發(fā)芽率為：45/50X100%=90%；曙紅染色法：47個(gè)具有活力，因此其發(fā)芽率為：47/50X100%=94%。分析：兩種方法測(cè)定的發(fā)芽率不一樣，可能是因?yàn)椋河蓴?shù)據(jù)可以看出，TTC染色的種子發(fā)芽率普遍比曙紅染色的低，可能是因?yàn)門TC染色法的染色部位是胚，曙紅染色法的染色部位是胚乳，并且在種子中胚比胚乳小很多，有的種子被蟲(chóng)吃了一部分，或者是切種子的時(shí)候另一半沒(méi)有切到胚，影響觀察結(jié)果，所以TTC染色的發(fā)芽率比曙紅染色的低。脯氨酸(Pro)含量測(cè)定：A520V總V顯V用Procontent干旱組1.2964.6ml6ml2ml55.20Mmol.g-1FW對(duì)照組0.0474.9ml6ml2ml2.13口mol.g-1FW計(jì)算過(guò)程：根據(jù)公式：Procontent=—一xF顯x—()Amol.g'1FW)

8xLxJV■用(式中E=3.24mol.cm,L=1cm,W=0.1g)帶入數(shù)據(jù)可求得ProcontentoProcontent計(jì)算結(jié)果為干旱組脯氨酸含量為55.2叩ol.g-1FW，對(duì)照組脯氨酸含量為2.13^mol.g-1FW.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，可以看出實(shí)驗(yàn)組的脯氨酸含量是對(duì)照組的25.9倍左右，表明遭受干旱脅迫時(shí)小麥幼苗中Pro含量迅速上升。(3)丙二醛(MDA)含量的測(cè)定:OD532OD450C1C2干旱組0.3470.95411.170mmol/L1.704mmol/L對(duì)照組0.0430.0510.597mmol/L0.249mmol/L計(jì)算過(guò)程：根據(jù)公式:OD450=C1X85.4OD^=C1X7.4+155000XC2解得:C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/(mmol/L)=6.45OD532-0.56OD450(式中，^為可溶性糖濃度，C2為MDA的濃度。)可計(jì)算出C1,c2的值。MDA(C2)計(jì)算結(jié)果為干旱組的MDA的濃度為1.704mmol/L，對(duì)照組的MDA的濃度為0.249mmol/L，干旱組為對(duì)照組的6.8倍左右，說(shuō)明當(dāng)遇到干旱脅迫時(shí)小麥幼苗中MDA含量比正常生長(zhǎng)的含量高。⑷Hg測(cè)定:V總V用V顯OD410H2Ocontent2干旱組4.8ml4ml4.2ml0.6389.924Hmol.g-1FW對(duì)照組4.7ml4ml4.2ml0.4762.305p,mol.g-1FW計(jì)算過(guò)程:根據(jù)公式：H2O2content=——(pmol.g-1FW)

xZxH7J7用(式中E=3.24mol.cm,L=1cm,W=0.1g)帶入表中的數(shù)據(jù)即可算出H2O2contento

H2O2content■日級(jí)如HtMlt計(jì)算結(jié)果得到干旱組中HO為9.924umol.g-1FW,對(duì)照組中HO為2.3052222umol.g-1FW，干旱組為對(duì)照組的4.3倍左右，說(shuō)明當(dāng)遇到干旱脅迫時(shí)小麥幼苗中H2O2H2O2content■日級(jí)如HtMlt（5）POD的測(cè)定:V總V顯V用干旱組5.5ml3.05ml3ml對(duì)照組5.2ml3.05ml3mlPOD在不同時(shí)間的A470值:0.5min1.5minPODactivities(t=0.5min)PODactivities(t=1.5min)干旱組0.1120.2533.87umol.g-1FWmin-12.91umol.g-1FWmin-1對(duì)照組0.0970.2283.17umol.g-1FWmin-12.48umol.g-1FWmin-1計(jì)算過(guò)程:根據(jù)公式:Am礦息PODactivities=xP顯x—(|imoi.g-1FWmin'1)ExJVxt雁(式中E=3.24mol.cm,W=0.1g)可計(jì)算分別出PODactivitieso

由上表可知，當(dāng)小麥幼苗遭受干旱脅迫時(shí)，過(guò)氧化物酶（POD）含量上升。(6)PPO的測(cè)定:V總V顯V用干旱組5.1ml3.1ml3ml對(duì)照組4.7ml3.1ml3mlPPO在不同時(shí)間的a410直:0.5min1.5minPPOactivities(t=0.5min)PPOactivities(t=1.5min)干旱組0.1210.139411.4U.g-1FW157.5U.g-1FW對(duì)照組0.1020.109319.6U.g-1FW113.8U.g-1FW計(jì)算過(guò)程:根據(jù)公式:4m■敬

PPOactivities=x—(U.q1FW)O.OlxFFx?可算出PPOactivities。

由上表可知，當(dāng)小麥幼苗遭受干旱脅迫時(shí)，多酚氧化酶(PPO)含量明顯上升。(7)GSH的測(cè)定:V總V用V顯A?412GSHcontent干旱組4.1ml2ml3.4ml0.80217.25umol.g-1FW對(duì)照組4.4ml2ml3.4ml0.1112.56umol.g-1FW計(jì)算過(guò)程：根據(jù)公式：GSHcontent=———xx—(pmoLg-1FW)LxW■用(式中E=3.24mol.cm,L=1cm,W=0.1g)帶入表中的數(shù)據(jù)即可算出GSHcontento由上述計(jì)算結(jié)果可知受到干旱脅迫的小麥幼苗的胚芽鞘中GSH含量是正常生長(zhǎng)的6.7倍左右，表明遭受干旱脅迫時(shí)小麥幼苗中GSH含量上升。討論：測(cè)定玉米發(fā)芽率時(shí)所用的兩種方法：TTC染色法和曙紅染色法。TTC染色法的染色部位是胚，染色較深，能清晰判別胚的死活，曙紅染色法的染色部位是胚乳，著色較淺。實(shí)驗(yàn)中玉米用兩種方法都發(fā)現(xiàn)有部分玉米種子的胚和胚乳被蟲(chóng)吃了一部分，雖然能被染色，但是在實(shí)際栽培中很難發(fā)芽，因此，這些種子判斷為不能正常發(fā)芽生長(zhǎng)，但總體來(lái)說(shuō)這批種子發(fā)芽率還是很高的。大量研究證實(shí)，水分脅迫下植物組織內(nèi)脯氨酸含量有普遍增高的現(xiàn)象⑶，有些研究表明脯氨酸累積的高低可以作為植物抗逆性篩選的指標(biāo)⑷，有些研究結(jié)果認(rèn)為逆境下脯氨酸含量的積累是植物受傷害的結(jié)果，不宜作為抗性篩選的指標(biāo)。該試驗(yàn)表明，在水分脅迫下，小麥幼苗脯氨酸（Pro）含量均有不同程度地高于對(duì)照，呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)。丙二醛（MDA）作為膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，其含量與質(zhì)膜相對(duì)透性具有相關(guān)性，是衡量植物受傷害程度的指標(biāo)之一，有研究認(rèn)為，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度與植物抗旱性密切相關(guān)，但丙二醛大量增加時(shí)，表明體內(nèi)細(xì)胞受到較嚴(yán)重的破壞［5］。一般來(lái)說(shuō)，MDA含量越高，表示植株受傷害程度越大。過(guò)氧化氫（H2O2）是植物代謝中產(chǎn)生的一種產(chǎn)物，其積累對(duì)細(xì)胞具有氧化破壞作用，在實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)其值的變化，來(lái)了解組織的破壞程度。因此，過(guò)氧化氫的含量也是植物逆境的一項(xiàng)指標(biāo)。水分脅迫等逆境條件使細(xì)胞活性氧代謝失調(diào)，O和HO等活性氧累積并超過(guò)膜傷害臨界值，從而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化作用加劇，但222植物可通過(guò)內(nèi)源性保護(hù)性酶促清除系統(tǒng)清除過(guò)多的活性氧，以保證細(xì)胞的正常機(jī)能。H2O2在本次試驗(yàn)中的結(jié)果是，干旱組的含量更高些。過(guò)氧化氫酶大量分布于動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)，屬于活性氧清除劑，對(duì)H2O2和羥自由基有清除能力，是一種細(xì)胞保護(hù)酶。細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)主要有超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶等。酶活性越高，消除自由基的能力也越強(qiáng)，植物的抗逆性也越強(qiáng)［5,6］。耐旱植物在適度的干旱條件下酶活性通常增高，清除酶活性氧的能力增強(qiáng)。PPO和POD均為植物內(nèi)源自由基清除劑，屬于保護(hù)酶系統(tǒng)⑺。在逆境中保護(hù)酶活性增強(qiáng)或維持較高的水平，能夠清除活性氧自由基使之保持較低的水平，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性。在干旱脅迫下，由于抗氧化酶與ROS的動(dòng)態(tài)平衡被打破，造成抗氧化酶（PPO、POD）的積累。在干旱脅迫下PPO、POD含量上升，POD催化其它底物與H2O2反應(yīng)以消耗H2O2植物在受水分脅迫及時(shí)復(fù)水，可誘導(dǎo)體內(nèi)POD活性上升，從而起到保護(hù)植物的作用。POD活性在干旱脅迫下增強(qiáng)，能通過(guò)增強(qiáng)POD活性來(lái)抵御干旱逆境對(duì)其所造成的傷害⑻。多酚氧化酶(PPO)是植物體內(nèi)酚類物質(zhì)氧化或縮合以及木質(zhì)素合成的重要酶，提高PPO活性可促進(jìn)植株體內(nèi)酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的合成和累積以提高植物抗性囪。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)中POD、PPO含量均上升，在干旱脅迫下，小麥幼苗的過(guò)氧化物酶(POD)活性都有所增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明遭受干旱脅迫時(shí)小麥幼苗中GSH含量迅速上升，干旱脅迫的小麥幼苗的GSH含量是正常生長(zhǎng)的7倍左右。在植物體內(nèi)活性氧的清除包括酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)，而谷胱甘肽(GSH)則是非酶系統(tǒng)中活性氧清除的重要抗氧化劑之一。GSH不僅可以直接清除HO,在葉綠體中還可以與抗壞血酸協(xié)同作用清除HO。2222對(duì)于GSH含量的測(cè)定，是一個(gè)良好的表示抗氧化脅迫的指標(biāo)。研究表明在水分脅迫下,GSH含量能增加至50倍以上，可提高植物的抗氧化能力[10]。谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸組成的天然三肽是一種含硫基的化合物，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干旱脅迫下谷胱甘肽含量比正常的顯著升高，說(shuō)明谷胱甘肽含量的升高使植物抗旱性增強(qiáng)。這次實(shí)驗(yàn)表明在干旱脅迫下，小麥幼苗生長(zhǎng)受到一定抑制作用，生理生化指標(biāo)發(fā)生一系列變化，表現(xiàn)為小麥幼苗中脯氨酸、丙二醛(mda)、H2O2、gsh、過(guò)氧化酶(POD、PPO)、GSH含量在干旱脅迫下含量較正常情況下的明顯升高(尤其是Pro和PPO的含量升高的幅度極顯著)，保護(hù)小麥的組織不受傷害，以提高小麥的抗旱能力。從總體上看，經(jīng)脅迫后的小麥抗逆性強(qiáng)于正常生長(zhǎng)的小麥。5.參考文獻(xiàn)：潘瑞熾.植物生理學(xué).第七版.高等教育出版社出版.2012：334-336.湯章城.植物對(duì)水分脅迫的反應(yīng)和適應(yīng)性一1.抗逆性的一般概念和植物的抗?jié)承訹J].植物生理學(xué)通訊,1983,(3):24-29.馬常耕.世界林木樹(shù)種抗逆性育種研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究,1995:4-12.湯章城.植物對(duì)水分脅迫的反應(yīng)和適應(yīng)性(2)[J].植物生理學(xué)通訊，1983(4)：1-7.張怡，羅曉芳，沈應(yīng)柏.土壤逐漸干早過(guò)程中刺槐新品種苗木抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,22(2):166—169.謝寅峰，沈惠娟.水分脅迫下3種針葉樹(shù)幼苗抗旱性與硝酸還原酶和超氧化物歧化酶活性的