植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件

植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術第一節(jié)實驗室及主要設備

第一節(jié)實驗室及主要設備主要內(nèi)容

植物組織培養(yǎng)的設計原則組培室的組成及其功能無菌操作設備常用工具常用儀器設備主要內(nèi)容植物組織培養(yǎng)的設計原則組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求便于隔離

實驗室設計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。實驗室的大小應取決于工作的目的和規(guī)模按組織培養(yǎng)流程來設計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂利用一定的設備、器材和特殊的實驗室結構設計，達到嚴格無菌的條件實驗室設計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。一、實驗室設置及儀器設備

實驗室是進行組培研究的主要場所，應能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲藏、無菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。一、實驗室設置及儀器設備實驗室是進行組培研究的主要場輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學實驗室溫室生化分析實驗室基本實驗室1.構成與配置輔助實驗室實驗室組成準備室細胞生物學實驗室基本實驗室1.構成基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及8植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件9植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件10AGlimpseofPlantTissueCultureAGlimpseof11（1）準備室所需器具的清洗、干燥和保存培養(yǎng)基的配制和滅菌生理生化測定等（1）準備室所需器具的清洗、干燥和保存組織培養(yǎng)準備實驗室組織培養(yǎng)準備實驗室13

1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實驗室的一側設置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實驗臺還應配置2個水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺洗瓶機。準備1-2個洗液缸，專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應耐濕并排水良好。1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積14植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件15面積60平方米左右，配備的主要儀器設備有：冰箱、天平、微波爐、pH計、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應有不同感量。2）培養(yǎng)基配制間面積60平方米左右，配備的主要儀器設備有：冰16植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件17

配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風滅火設備、細菌過濾設備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實驗室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實驗室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個準備間，要求是設備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風，地面要便于清潔、防滑。

3）

消毒間

配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風滅火設備、細菌過18（2）緩沖室（注意門的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩功能減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。要求緩沖間需3-5平方米，應保持清潔無菌；有清潔的實驗用拖鞋、已滅菌過的工作服；

1-2盞紫外燈定時照射，對衣物及空間進行滅菌。（2）緩沖室（注意門的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴19植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件20植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件21

無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應該與接種室的門錯開，兩個門也不要同時開啟，以保證無菌室不因開門和人的進出帶進雜菌。緩沖間內(nèi)應該設有水槽、實驗臺、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應當用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應配有超凈工作臺，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。（3）

無菌操作室

無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作，所以又叫接種室。通22無菌室（一）無菌室（一）23無菌室（二）無菌室（二）24植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件25植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件26

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應當留一個通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應有一預備間或走廊。

培養(yǎng)室應配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動控時器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強度為2000-3000lx。

（4）培養(yǎng)室

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強度，培養(yǎng)27植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件28植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件29培養(yǎng)室培養(yǎng)室30

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進行練苗，待生根成活后，再移到大田。植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進行312．輔助實驗室（1）鑒定室

細胞學鑒定室

其功能是對培養(yǎng)材料進行細胞學鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。應配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。

生化分析室在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應建立相應的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。離心機、酶聯(lián)免疫檢測儀、天平、PCR儀等。2．輔助實驗室（1）鑒定室32植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件33

為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。（2）溫室

為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。（2）溫室34二、儀器和設備（一）無菌操作設備１.烘箱：作用：干燥洗后的器皿高溫干熱滅菌

測定培養(yǎng)物的干重時烘干培養(yǎng)材料。二、儀器和設備（一）無菌操作設備35植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件362.滅菌鍋類型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種用具的消毒2.滅菌鍋類型：普通醫(yī)用消毒鍋37醫(yī)用手提式滅菌鍋

醫(yī)用手提式滅菌鍋38不銹鋼立式滅菌鍋不銹鋼立式滅菌鍋393.超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)類型：垂直式和水平式作用：無菌操作3.超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)40（二）藥品貯存和配制儀器設備1.冰箱作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。（二）藥品貯存和配制儀器設備1.冰箱412.天平陳列于制備室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑2.天平陳列于制備室中423.酸度計陳列于制備室中作用：測定培養(yǎng)基及酶制劑的pH值PHS-802中文臺式酸度計通用型或經(jīng)濟型酸度計3.酸度計陳列于制備室中PHS-802中文臺式酸度計通用型或43（三）觀察分析儀器設備顯微鏡類型：倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細胞活力觀察電子顯微鏡病毒檢測、細胞器變化體視顯微鏡形態(tài)分化的實體觀察（三）觀察分析儀器設備顯微鏡44植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件45（四）培養(yǎng)設備1.空調(diào)作用：控制培養(yǎng)溫度2.加濕器和去濕機控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度狀況（四）培養(yǎng)設備1.空調(diào)463.定時器控制光照時間4.培養(yǎng)架盛放培養(yǎng)物3.定時器控制光照時間475.搖床和旋轉(zhuǎn)床進行液體培養(yǎng)時用以改善氣體狀況5.搖床和旋轉(zhuǎn)床48小型臭氧發(fā)生器小型臭氧發(fā)生器49不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）50三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等2.分注器類型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃儀器燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑瓶等三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿51（二）器械類1.鑷子類型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷子（莖尖）2.剪刀類型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀3.解剖刀類型：固定式和活動式4.接種針用來轉(zhuǎn)移細胞或愈傷組織5.細菌過濾器用來去除細菌（高溫的影響）（二）器械類1.鑷子52植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件53植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件54

1.洗滌液的配制

二、實驗基本操作（一）洗滌技術

1.洗滌液的配制

二、實驗基本操作（一）洗滌技術55

A、新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。

2.洗滌方法

A、新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用56

先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

B、使用過的玻璃儀器的清洗

先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉57

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學實驗中已用的越來越多。第一次使用塑料器皿時，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH=1）清洗，接著依次用無離子水、1mol/LKOH和無離子水清洗，然后用10—3mol/LEDTA除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。

C、塑料器皿的清洗

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學實驗中已58

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

E、除菌過濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。

D、金屬用品洗滌

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈59植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件干熱滅菌玻璃器皿、器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室。培養(yǎng)間各種滅菌方法及其使用范圍干熱滅菌玻璃器皿、器械各種滅菌方62

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160℃、90～120min1）干熱滅菌

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、4063

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃維持20～30min

注意點：加足水、排盡氣、氣壓降到0時，才能開蓋2）濕熱滅菌

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃64

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌

滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22～0.45微米。制培養(yǎng)基時，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時，加入適量的激素，然后分裝。

3）過濾滅菌

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些65主要是利用紫外燈進行照射，適合實驗室空氣、操作臺等，滅菌時間20～30min。

注意：關燈后5min后再進入。超凈工作臺關燈后要打開風機。4）射線滅菌主要是利用紫外燈進行照射，適合實驗室空氣、操作臺等，滅菌時間66

用火焰灼燒達到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒滅菌

用火焰灼燒達到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒67

適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較

消毒劑使用濃度(%)消毒時間(min.)效果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最難過氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難次氯酸鈣/納9～105～30好易6）消毒劑

適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的68

長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準備妥當后，把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)(最好在碗或杯下面鋪一張報紙，以利清洗)，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當它與一部分甲醛作用時，由氧化反應產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。7）熏蒸滅菌

長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏69

甲醛熏蒸接種室應至少在使用前24小時進行，熏蒸后密閉保持4小時以上再進入室內(nèi)工作。甲醛對人的眼、鼻有強烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應，以消除甲醛味，減少對人體的刺激作用。使用氨水應在工作前2小時進行。

對有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸

甲醛熏蒸接種室應至少在使用前24小時進行，熏蒸后密閉保持470人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→泡75%~95%酒精→燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細菌：用水沖洗→化學藥劑處理內(nèi)部細菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺用化學試劑薰蒸污染來源（三）無菌操作技術

人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因71

1.實驗器具和材料的準備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3.關紫外燈、打開風機，過5-10min進入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）

1.實驗器具和材料的準備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作724.用70－75％的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗用具也應該用酒精消毒。點燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應在火焰近處并經(jīng)過灼燒進行。金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。4.用70－75％的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗用具也應該用735.取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3～4次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進行分離、切割或其他處理。5.取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸746.打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7.用酒精擦洗工作臺和手。進行下一輪操作。6.打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培75注意（1）進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。（3）為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復使用，應立即封閉瓶口直立可增加落菌機會。注意（1）進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣76（5）吸取營養(yǎng)液、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或?qū)е录毎徊嫖廴尽?/p>

（6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。

（7）手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應將吸管丟掉。（5）吸取營養(yǎng)液、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管77植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

83植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制86主要內(nèi)容一、培養(yǎng)基的成分

二、培養(yǎng)基的配制三、常用培養(yǎng)基配方及其特點

主要內(nèi)容87一、培養(yǎng)基的成分

水無機鹽炭源和能源

維生素類

氨基酸及有機附加物

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

瓊脂

活性炭

一、培養(yǎng)基的成分水88（一）無機營養(yǎng)

無機營養(yǎng)包括水和各種無機鹽，它們提供了除碳源以外的幾乎所有的營養(yǎng)元素。1.水是植物原生質(zhì)的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒，為生命活動不可缺少。配制培養(yǎng)基時一般用離子交換水、蒸餾水、重蒸餾水。（一）無機營養(yǎng)無機營養(yǎng)包括水和各種無機鹽，它們1892.無機鹽

無機鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫、氧、氮、磷、鉀、硫、鈣、氯、鎂。氮通常是指硝態(tài)氮或氨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝態(tài)氮形式來滿足培養(yǎng)物對氮素的需求，或?qū)煞N混合使用，有時也以硝態(tài)氮為主，補加（NH4）2SO4以滿足酸性植物的需要。磷是植物的必須元素之一，參與植物生命活動中核酸、蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用、及能量的貯存、轉(zhuǎn)化與釋放等重要生理生化過程，因此在組織培養(yǎng)物中需大量的磷。鉀是主要的陽離子，近年來在培養(yǎng)基中的用量呈逐漸提高的趨勢。鈣、鈉、鎂的用量較少。微量元素是指鐵、硼、錳、鋅、鈷、鉬、銅等，其需要量很少，一般多為10-5~10-7mol.L-1，稍多則產(chǎn)生毒害。

2.無機鹽無機鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫901.碳源(能源)

植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作用的能力較低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物作為生長發(fā)育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖為最常用，效果也最好。然而在體細胞組織培養(yǎng)中，葡萄糖、麥芽糖和山梨醇也有影響；在花藥培養(yǎng)中，麥芽糖也有促進作用。糖類在培養(yǎng)基中除了作為碳源和能源以外，還具有維持培養(yǎng)基一定的滲透壓的作用。大多數(shù)植物細胞對蔗糖的需求范圍是1%~5%，但個別植物組織培養(yǎng)中蔗糖的濃度也可高達7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花藥培養(yǎng)。一般來說，蔗糖作為碳源和滲透劑的比例約為3：1~3：2，即約有1/4~2/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓。

（二）有機成分1.碳源(能源)植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作912.維生素類

維生素類與植物體內(nèi)各種酶的形成有關。維生素的種類很多，在植物組織培養(yǎng)中通常以B族維生素為主，使用濃度一般為0.1~1.0mg/L，其中以鹽酸硫胺素（B1）、鹽酸吡哆素（B6）、維生素B12、煙酸、生物素和維生素C最為常用。在各種維生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只對外植體的生長起促進作用。肌醇本身不促進外植體的生長，但可能有助于活性物質(zhì)發(fā)揮作用，從而促進外植體生長、胚狀體及芽的形成。培養(yǎng)基中肌醇的用量為50~100mg/L。2.維生素類維生素類與植物體內(nèi)各種酶的形成有關。維生素的種923.氨基酸及有機添加物

在一些培養(yǎng)基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）等，它們是培養(yǎng)基中重要的有機氮源。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多種氨基酸的混合物，對胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進作用，常用量為500mg/L。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多種氨基酸的混合物，對胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進作用，常用量為500mg/L。

在某些植物組織培養(yǎng)中還加入一些天然的有機物，例如椰子乳10~20%，酵母提取物0.5%，番茄汁5~10%，香蕉泥100~200mg/L，其作用是提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素等。如培養(yǎng)基中加入100~200mg/L的香蕉泥，具有較大的pH緩沖作用，主要用于蘭花的組織培養(yǎng)，對幼苗的發(fā)育有較大的促進作用。

3.氨基酸及有機添加物在一些培養(yǎng)基中可加入一些氨基酸，如甘93（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關鍵物質(zhì)，其用量雖極少，但它們對外植體愈傷組織的誘導和器官分化起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用，其中以生長素類和細胞分裂素最為常用。（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關鍵941.生長素

它們的主要作用是誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細胞分裂素誘導腋芽及不定芽的產(chǎn)生。生長素常用的是2.4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸），它們作用的強弱順序為2.4-D>NAA>IBA>IAA。2,4-D常用于誘導愈傷組織，NAA、IBA、IAA常用于生根。使用濃度范圍一般為0.1mg/l~10.0mg/l。1.生長素它們的主要作用是誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生952.細胞分裂素

它們的主要作用是促進細胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進芽的生長及顯著改變其它的激素的作用。常用的細胞分裂素類有：激動素（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-異戊烯腺嘌呤（2-iP）、吡效隆（4PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ）。它們作用的強弱順序為TDZ>4PU>ZT>2-Ip>6-BA>KT。但在組織培養(yǎng)中通常使用人工合成的、性能穩(wěn)定的而價格適中的KT和6-BA，二者的最適濃度為1-10mg/L。它們作用的強弱順序為TDZ，4PU>ZT>2-Ip>6-BA>KT。常用濃度為1-10mg/L。2.細胞分裂素它們的主要作用是促進細胞的分裂和器官的分化、96(四)瓊脂瓊脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，同時不參與代謝，所以在組織培養(yǎng)中一直被作為首選的培養(yǎng)基質(zhì)而廣泛應用。(四)瓊脂瓊脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，它的主97(五)活性炭活性炭加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響。例如可以防止酚類物質(zhì)的污染而引起組織褐化死亡。在蘭花組織培養(yǎng)中的效果更明顯。另外，活性炭使培養(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根?；钚蕴繉π螒B(tài)發(fā)生和器官形成有良好的效應。常用濃度為0.1~0.5%。(五)活性炭活性炭加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，98二、培養(yǎng)基的配制準備工作

母液的配制和保存

培養(yǎng)基配制程序培養(yǎng)基配制程序

二、培養(yǎng)基的配制991.水和藥品

用于配制培養(yǎng)基的水最好是用玻璃容器蒸餾過的蒸餾水或去離子水；化學藥品應盡可能采用分析純或化學純級別的試劑；生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在應用前有時還需要進行重結晶或選用純度更高的；蛋白質(zhì)水解物最好是用酶水解的；藥品的稱量及定容都要準確。1.水和藥品用于配制培養(yǎng)基的水最好是用玻璃容器蒸餾過的1002.母液的配制和保存配制培養(yǎng)基最方便的方法是預先配制好不同組分的培養(yǎng)基母液，配成培養(yǎng)基配方使用濃度的10倍100倍，甚至1000倍；在配制母液時為減少工作量可以把幾種藥品（如培養(yǎng)基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但應注意各種化合物的組合以及加入的先后順序，以免發(fā)生沉淀；鐵鹽宜單獨配制；對于植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，配制成母液時，通常用mg/ml較為方便，一般宜配制成0.5mg/ml的母液，這樣的濃度既便于計算也可避免冷藏時形成的結晶。2.母液的配制和保存配制培養(yǎng)基最方便的方法是預先配制好不同101由于多數(shù)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水，因此配法各不相同：IAA，IBA和GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，搖勻后貯于試劑瓶中，貼上標簽后存放在冰箱中；NAA可溶于熱水或少量95%酒精中，再加水定容至一定體積；2，4-D不溶于水，可用少量1N的NaOH溶解后，再加水定容；KT和6-BA應先溶于少量1N的HCl中，再加水定容；玉米素先溶于少量95%的酒精中再加水定容至一定濃度。椰子汁的活性成分是耐熱的，椰子汁從椰子中倒出后應立即煮沸過濾去除蛋白質(zhì)，高壓消毒后貯于-20℃低溫冰箱中備用。由于多數(shù)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水，因此配法各不相同：1023.培養(yǎng)基配制程序3.培養(yǎng)基配制程序103三、常用培養(yǎng)基及其特點MS培養(yǎng)基是1962年Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草材料而設計的。特點是無機鹽的濃度高，有加速愈傷組織生長的作用，能滿足植物組織對礦質(zhì)營養(yǎng)的要求。銨鹽和硝酸鹽含量高，比例也較為合適，也不需要添加更多的有機附加物，這是目前應用的最廣泛的一種培養(yǎng)基。與MS較為接近的還有LS、RM、等培養(yǎng)基。N6培養(yǎng)基是1974年由我國的朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的，其KNO3和（NH4）2SO4高且不含鉬。目前在國內(nèi)已廣泛用于小麥、水稻及其它植物的花粉和花藥的培養(yǎng)和其它的組織培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基它的主要特點是含有較低的銨鹽，該營養(yǎng)成分可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用，對有些植物如雙子葉植物特別是木本植物更加適合。三、常用培養(yǎng)基及其特點MS培養(yǎng)基是1962年Murashig104第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)105外植體的選擇1外植體的滅菌2外植體的接種培養(yǎng)3外植體的成苗途徑4污染的原因及其預防措施5外植體的褐變及其防止措施6培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預防措施7外植體的選擇1外植體的滅菌2外植體的接種培養(yǎng)3外植體的成106一、外植體的選擇1.選擇優(yōu)良品種2.選擇健壯植株3.選擇最適時期4.選擇適宜的大小0.5～1.0cm一、外植體的選擇1.選擇優(yōu)良品種107二、外植體的滅菌1.外植體滅菌的流程把采來的材料事先截剪，除去不用的部分將需要的部分仔細弄干凈，用流水沖洗肥皂水浸洗自來水沖洗70%~75%的酒精浸泡30s滅菌劑滅菌無菌水沖洗遍3~5遍接種。二、外植體的滅菌1.外植體滅菌的流程1082.滅菌劑的種類（1）70%~75%酒精比其他濃度的酒精殺菌效果強，組織穿透力也強。它對材料氣泡內(nèi)空氣進行殺菌，可以濕潤材料，有利于其他消毒劑的滲入，具濕潤和殺菌的雙重作用。酒精滅菌時間不宜過長，浸漬30s可達表面滅菌。因不能徹底殺菌，往往需用其他滅菌劑滅菌。2.滅菌劑的種類109（2）氯化汞這是一種重金屬化合物，有劇毒。對人、動物和植物的毒性非常大。常用濃度為1%，處理時間5~10min，殺菌效果好，但殘毒很大。外植體滅菌后，需用無菌水沖洗至少3~5次。（3）次氯酸鈉濃度可為2%~10%，消毒時間15~30min，殺菌效果比較好，很容易去除，對植物無害。（2）氯化汞110（4）漂白粉這是一種常用的低毒的消毒劑，是含有多種成分的復合化合物，一般含10%~20%的次氯酸鈣。使用濃度一般為5%~10%，或飽和溶液，取其上清液，處理10~30min，殺菌效果好，且不傷組織，容易洗凈。（4）漂白粉111（5）次氯酸鈣粉狀，可以很好溶解于水，待澄清后取上清液用以消毒，常用濃度為9%~10%，消毒時間為5~30min。次氯酸鈣進入植物組織內(nèi)的速度低于次氯酸鈉。由于它易潮解，只能存儲有限時間。（5）次氯酸鈣112三、外植體的接種和培養(yǎng)（一）外植體的接種——無菌操作外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。

三、外植體的接種和培養(yǎng)（一）外植體的接種——無菌操作外植體的1131．無菌操作（1）接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進行滅菌；

（2）在接種前20min，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿托鞋等；（4）上工作臺后，用（70%）酒精棉球擦拭工作臺面；然后擦拭雙手，特別是指甲處。1．無菌操作114（5）先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；（6）接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；（7）接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。（5）先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一1151234561234561162.接種(1)將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或濾紙上。(2)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈?。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。2.接種117(3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。(3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基118（二）外植體的培養(yǎng)（二）外植體的培養(yǎng)1191.光照通常對愈傷組織的誘導來說，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更適合，但器官的分化需要光照。每日光照12~16h，光照度1000~5000lx如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養(yǎng)。1.光照1202.溫度大多數(shù)植物在23~32℃之間。培養(yǎng)室一般所用的溫度是25±2℃。低于15℃或高于35℃，對生長都不利。3.濕度培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度；培養(yǎng)室的濕度要求室內(nèi)保持70%~80%的相對濕度。4.氧氣液體培養(yǎng)：振蕩培養(yǎng)固體培養(yǎng)：采用通氣性好的瓶蓋或瓶塞。2.溫度121四、外植體的成苗途徑外植體愈傷組織根、芽芽根根芽根、芽胚狀體試管苗從器官上發(fā)生從愈傷組織發(fā)生從游離單細胞發(fā)生從小孢子發(fā)生數(shù)量多速度快結構完整四、外植體的成苗途徑外植體愈傷組織根、芽芽根根芽根、芽胚狀體122五、污染的原因及其預防措施（一）污染的原因污染：指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。污染的原因：病原菌污染：細菌、真菌；污染的途徑外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿帶菌；操作人員未遵守操作規(guī)程等。五、污染的原因及其預防措施（一）污染的原因123植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件124（二）污染的預防措施1．防止材料帶菌的措施取材以春夏生長旺季，當年生的嫩梢為佳；應盡量選擇晴天中午進行；取離體枝梢在潔凈空氣條件下抽芽，然后從新生組織中取材接種。（二）污染的預防措施1252.外植體的滅菌根據(jù)不同材料選擇合適的消毒劑和消毒方法。對于材料內(nèi)部帶菌的組織，有時還需在培養(yǎng)基中加入適量抗生素。多次滅菌法；多種藥液交替浸泡法。3.器皿與金屬器械的滅菌4.布質(zhì)制品及無菌操作室的滅菌5.操作人員嚴格按照無菌操作的程序進行接種2.外植體的滅菌126六、外植體的褐變及其防止措施褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中，體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會抑制其他酶的活性，嚴重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐而死亡的現(xiàn)象。六、外植體的褐變及其防止措施褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中，體內(nèi)127植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件128（一）褐變的原因①植物品種多酚氧化酶活性上的差異。②生理狀態(tài)老熟的組織褐變程度較幼嫩的組織嚴重。③培養(yǎng)基成分無機鹽和細胞分裂素濃度過高。④培養(yǎng)條件不當如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長。（一）褐變的原因129（二）褐變的防止措施1.選擇合適的外植體一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。2.合適的培養(yǎng)條件無機鹽成分、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。（二）褐變的防止措施130

3.使用抗氧化劑半胱氨酸、抗壞血酸；4.連續(xù)轉(zhuǎn)移對容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，連續(xù)處理7~l0d。5.加活性炭0.1%~0.5%的活性炭對吸附酚類氧化物的效果很明顯。3.使用抗氧化劑131七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預防措施（一）玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈水晶透明或半透明狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化的起因是細胞生長過程中的環(huán)境變化。試管苗為了適應變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預防措施（一）玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原132

1.激素濃度激素濃度增加尤其是細胞分裂素濃度提高（或細胞分裂素與生長素比例提高），易導致玻璃化苗的產(chǎn)生。培養(yǎng)基中一次性加入了過多的細胞分裂素；細胞分裂素與生長素比例失調(diào)；在多次繼代培養(yǎng)時愈傷組織和試管苗體內(nèi)積累過量的細胞分裂素。1.激素濃度133

2.瓊脂濃度培養(yǎng)基中瓊脂濃度低時玻璃化苗比例增加。隨著瓊脂濃度的增加，玻璃化苗比例減少。

3.溫度適宜的溫度可以使試管苗生長良好，當溫度低時，容易形成玻璃化苗，溫度越低，玻璃化苗比例越高。溫度高時玻璃化苗減少，且發(fā)生的時間較晚。2.瓊脂濃度134

4.光照時間不同的植物對光照的要求不同，滿足植物的光照時間，試管苗才能生長正常。大多數(shù)植物在每天10~12h光照下都能生長良好，光照時數(shù)大于每天15h時，玻璃化苗的比例明顯增加。

5.通風條件試管苗生長期間，要求有足夠的氣體交換，氣體交換的好壞取決于生長量、瓶內(nèi)空間、培養(yǎng)時間和瓶蓋種類（棉塞、錫箔紙、濾紙、封口紙、牛皮紙、塑料膜）。4.光照時間135

6.離子水平植物生長需要一定的礦物質(zhì)營養(yǎng)，但是，如果無機離子之間失去平衡，試管苗生長就會受到影響。植物種類不同，對礦物質(zhì)的量、離子形態(tài)、離子間的比例要求不同。如果培養(yǎng)基中離子種類及其比例不適宜該種植物，玻璃化苗的比例就會增加。6.離子水平136（二）預防措施1.適當控制培養(yǎng)基中無機營養(yǎng)成分；2.適當提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度；3.適當降低細胞分裂素和赤霉素的濃度；4.增加自然光照，控制光照時間；5.控制好溫度；6.改善培養(yǎng)器皿的氣體交換狀況；7.在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)。（二）預防措施137植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件138第四節(jié)試管苗的馴化與移栽第四節(jié)試管苗的馴化與移栽139試管苗的特點1試管苗的馴化2試管苗的移栽

3提高試管苗移栽成活率的途徑4試管苗的特點1試管苗的馴化2試管苗的移栽3提高試管苗移栽成140一、試管苗的特點

1.試管苗的生態(tài)環(huán)境（1）高溫且恒溫（2）高濕（3）弱光（4）無菌一、試管苗的特點1.試管苗的生態(tài)環(huán)境141

2.試管苗的特點(1)試管苗生長細弱，莖、葉表面角質(zhì)層不發(fā)達；(2)試管苗莖、葉雖呈綠色，但葉綠體的光合作用較差；(3)試管苗的葉面氣孔數(shù)目少，活性差；(4)試管苗根的吸收功能弱；(5)對逆境的適應和抵抗能力差。2.試管苗的特點142二、試管苗的馴化1.馴化的目的提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應性；提高其光合作用的能力；促使試管苗健壯，最終達到提高試管苗的移栽成活率。2.馴化的原則應從溫度、濕度、光照及有無菌態(tài)等環(huán)境要素進行，馴化開始數(shù)天內(nèi)，應和培養(yǎng)時的環(huán)境條件相似；馴化后期，則要與預計的栽培條件相似，從而達到逐步適應的目的。二、試管苗的馴化1.馴化的目的1433.馴化的方法將長有完整試管苗的試管或三角瓶由培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到半遮蔭的自然光下進行鍛煉，在自然光下恢復植物體內(nèi)葉綠體的光合作用能力和健壯度，并打開瓶蓋注入少量自來水使幼苗逐漸降低溫度，轉(zhuǎn)向有菌，這樣幼苗周圍的環(huán)境就會逐步與自然環(huán)境相似。4.馴化時間：1~2周。3.馴化的方法144三、試管苗的移栽1.常規(guī)移栽法將馴化后的試管苗，取出洗去培養(yǎng)基，移到無菌混合土中（蛭石、珍珠巖、泥炭土或其混合物），當長出2~3片新葉時，栽到田間或盆缽中。2.直接移栽法直接將試管苗移栽到盆缽的方法。

三、試管苗的移栽1.常規(guī)移栽法1453.嫁接移栽法選取生長良好的同一植物的實生苗作砧木，用試管苗做接穗嫁接的方法。嫁接移栽優(yōu)點：（1）移栽成活率高。（2）適用范圍廣，嫁接移栽也適用于弱苗或污染苗。（3）需時間短，20天成活。（4）植株生長發(fā)育較快。3.嫁接移栽法146四、提高試管苗移栽成活率的途徑1.試管苗的生理狀況：壯苗移栽比弱苗移栽成活率高。2.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長素利于生根。3.無機鹽濃度：低無機鹽濃度生根效果好。4.活性炭：活性炭利于嫩莖生根。5.環(huán)境因子：避免太陽直射，溫度25~30℃，濕度在85%以上。6.移栽過程中使試管苗逐漸從無菌向有菌過渡。四、提高試管苗移栽成活率的途徑1.試管苗的生理狀況：壯苗移栽147本章小結1.構成培養(yǎng)基的主要成分。常用的培養(yǎng)基及其特點。2.母液的配制

3.外植體滅菌的流程

4.植物組織培養(yǎng)技術包括滅菌、接種、培養(yǎng)和馴化四個環(huán)節(jié)。

5.接種程序包括①植物材料表面的消毒；②切割外植體；③將外植體移入培養(yǎng)基。6.外植體的成苗途徑7.菌類污染、褐變、玻璃化的預防措施。8.試管苗馴化的目的及方法；試管苗移栽的方法。9.提高試管苗移栽成活率的途徑。本章小結1.構成培養(yǎng)基的主要成分。常用的培養(yǎng)基及其特點。148END!END!植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術植物組織培養(yǎng)第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術第一節(jié)實驗室及主要設備

第一節(jié)實驗室及主要設備主要內(nèi)容

植物組織培養(yǎng)的設計原則組培室的組成及其功能無菌操作設備常用工具常用儀器設備主要內(nèi)容植物組織培養(yǎng)的設計原則組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求便于隔離

實驗室設計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。實驗室的大小應取決于工作的目的和規(guī)模按組織培養(yǎng)流程來設計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂利用一定的設備、器材和特殊的實驗室結構設計，達到嚴格無菌的條件實驗室設計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。一、實驗室設置及儀器設備

實驗室是進行組培研究的主要場所，應能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲藏、無菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。一、實驗室設置及儀器設備實驗室是進行組培研究的主要場輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學實驗室溫室生化分析實驗室基本實驗室1.構成與配置輔助實驗室實驗室組成準備室細胞生物學實驗室基本實驗室1.構成基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及157植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件158植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件159AGlimpseofPlantTissueCultureAGlimpseof160（1）準備室所需器具的清洗、干燥和保存培養(yǎng)基的配制和滅菌生理生化測定等（1）準備室所需器具的清洗、干燥和保存組織培養(yǎng)準備實驗室組織培養(yǎng)準備實驗室162

1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實驗室的一側設置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實驗臺還應配置2個水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺洗瓶機。準備1-2個洗液缸，專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應耐濕并排水良好。1）洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積163植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件164面積60平方米左右，配備的主要儀器設備有：冰箱、天平、微波爐、pH計、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應有不同感量。2）培養(yǎng)基配制間面積60平方米左右，配備的主要儀器設備有：冰165植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件166

配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風滅火設備、細菌過濾設備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實驗室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實驗室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個準備間，要求是設備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風，地面要便于清潔、防滑。

3）

消毒間

配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風滅火設備、細菌過167（2）緩沖室（注意門的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩功能減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。要求緩沖間需3-5平方米，應保持清潔無菌；有清潔的實驗用拖鞋、已滅菌過的工作服；

1-2盞紫外燈定時照射，對衣物及空間進行滅菌。（2）緩沖室（注意門的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴168植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件169植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件170

無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應該與接種室的門錯開，兩個門也不要同時開啟，以保證無菌室不因開門和人的進出帶進雜菌。緩沖間內(nèi)應該設有水槽、實驗臺、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應當用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應配有超凈工作臺，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。（3）

無菌操作室

無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作，所以又叫接種室。通171無菌室（一）無菌室（一）172無菌室（二）無菌室（二）173植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件174植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件175

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應當留一個通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應有一預備間或走廊。

培養(yǎng)室應配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動控時器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強度為2000-3000lx。

（4）培養(yǎng)室

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強度，培養(yǎng)176植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件177植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件178培養(yǎng)室培養(yǎng)室179

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進行練苗，待生根成活后，再移到大田。植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進行1802．輔助實驗室（1）鑒定室

細胞學鑒定室

其功能是對培養(yǎng)材料進行細胞學鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。應配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。

生化分析室在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應建立相應的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。離心機、酶聯(lián)免疫檢測儀、天平、PCR儀等。2．輔助實驗室（1）鑒定室181植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件182

為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。（2）溫室

為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。（2）溫室183二、儀器和設備（一）無菌操作設備１.烘箱：作用：干燥洗后的器皿高溫干熱滅菌

測定培養(yǎng)物的干重時烘干培養(yǎng)材料。二、儀器和設備（一）無菌操作設備184植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件1852.滅菌鍋類型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種用具的消毒2.滅菌鍋類型：普通醫(yī)用消毒鍋186醫(yī)用手提式滅菌鍋

醫(yī)用手提式滅菌鍋187不銹鋼立式滅菌鍋不銹鋼立式滅菌鍋1883.超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)類型：垂直式和水平式作用：無菌操作3.超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)189（二）藥品貯存和配制儀器設備1.冰箱作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。（二）藥品貯存和配制儀器設備1.冰箱1902.天平陳列于制備室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑2.天平陳列于制備室中1913.酸度計陳列于制備室中作用：測定培養(yǎng)基及酶制劑的pH值PHS-802中文臺式酸度計通用型或經(jīng)濟型酸度計3.酸度計陳列于制備室中PHS-802中文臺式酸度計通用型或192（三）觀察分析儀器設備顯微鏡類型：倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細胞活力觀察電子顯微鏡病毒檢測、細胞器變化體視顯微鏡形態(tài)分化的實體觀察（三）觀察分析儀器設備顯微鏡193植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件194（四）培養(yǎng)設備1.空調(diào)作用：控制培養(yǎng)溫度2.加濕器和去濕機控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度狀況（四）培養(yǎng)設備1.空調(diào)1953.定時器控制光照時間4.培養(yǎng)架盛放培養(yǎng)物3.定時器控制光照時間1965.搖床和旋轉(zhuǎn)床進行液體培養(yǎng)時用以改善氣體狀況5.搖床和旋轉(zhuǎn)床197小型臭氧發(fā)生器小型臭氧發(fā)生器198不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）199三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等2.分注器類型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃儀器燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑瓶等三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿200（二）器械類1.鑷子類型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷子（莖尖）2.剪刀類型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀3.解剖刀類型：固定式和活動式4.接種針用來轉(zhuǎn)移細胞或愈傷組織5.細菌過濾器用來去除細菌（高溫的影響）（二）器械類1.鑷子201植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件202植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件203

1.洗滌液的配制

二、實驗基本操作（一）洗滌技術

1.洗滌液的配制

二、實驗基本操作（一）洗滌技術204

A、新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。

2.洗滌方法

A、新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用205

先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

B、使用過的玻璃儀器的清洗

先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉206

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學實驗中已用的越來越多。第一次使用塑料器皿時，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH=1）清洗，接著依次用無離子水、1mol/LKOH和無離子水清洗，然后用10—3mol/LEDTA除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。

C、塑料器皿的清洗

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學實驗中已207

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

E、除菌過濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。

D、金屬用品洗滌

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈208植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件干熱滅菌玻璃器皿、器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室。培養(yǎng)間各種滅菌方法及其使用范圍干熱滅菌玻璃器皿、器械各種滅菌方211

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160℃、90～120min1）干熱滅菌

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40212

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃維持20～30min

注意點：加足水、排盡氣、氣壓降到0時，才能開蓋2）濕熱滅菌

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃213

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌

滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22～0.45微米。制培養(yǎng)基時，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時，加入適量的激素，然后分裝。

3）過濾滅菌

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些214主要是利用紫外燈進行照射，適合實驗室空氣、操作臺等，滅菌時間20～30min。

注意：關燈后5min后再進入。超凈工作臺關燈后要打開風機。4）射線滅菌主要是利用紫外燈進行照射，適合實驗室空氣、操作臺等，滅菌時間215

用火焰灼燒達到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒滅菌

用火焰灼燒達到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。5）火焰灼燒216

適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較

消毒劑使用濃度(%)消毒時間(min.)效果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最難過氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難次氯酸鈣/納9～105～30好易6）消毒劑

適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的217

長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準備妥當后，把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)(最好在碗或杯下面鋪一張報紙，以利清洗)，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當它與一部分甲醛作用時，由氧化反應產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。7）熏蒸滅菌

長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏218

甲醛熏蒸接種室應至少在使用前24小時進行，熏蒸后密閉保持4小時以上再進入室內(nèi)工作。甲醛對人的眼、鼻有強烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應，以消除甲醛味，減少對人體的刺激作用。使用氨水應在工作前2小時進行。

對有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸

甲醛熏蒸接種室應至少在使用前24小時進行，熏蒸后密閉保持4219人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→泡75%~95%酒精→燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細菌：用水沖洗→化學藥劑處理內(nèi)部細菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺用化學試劑薰蒸污染來源（三）無菌操作技術

人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因220

1.實驗器具和材料的準備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3.關紫外燈、打開風機，過5-10min進入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）

1.實驗器具和材料的準備

2.用75%的酒精擦拭超凈工作2214.用70－75％的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗用具也應該用酒精消毒。點燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應在火焰近處并經(jīng)過灼燒進行。金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。4.用70－75％的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗用具也應該用2225.取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3～4次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進行分離、切割或其他處理。5.取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸2236.打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7.用酒精擦洗工作臺和手。進行下一輪操作。6.打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培224注意（1）進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。（3）為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復使用，應立即封閉瓶口直立可增加落菌機會。注意（1）進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣225（5）吸取營養(yǎng)液、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或?qū)е录毎徊嫖廴尽?/p>

（6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。

（7）手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應將吸管丟掉。（5）吸取營養(yǎng)液、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管226植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

232植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件植物組織培養(yǎng)實驗室的構建和操作技術課件第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制235主要內(nèi)容一、培養(yǎng)基的成分

二、培養(yǎng)基的配制三、常用培養(yǎng)基配方及其特點

主要內(nèi)容236一、培養(yǎng)基的成分

水無機鹽炭源和能源

維生素類

氨基酸及有機附加物

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

瓊脂

活性炭

一、培養(yǎng)基的成分水237（一）無機營養(yǎng)

無機營養(yǎng)包括水和各種無機鹽，它們提供了除碳源以外的幾乎所有的營養(yǎng)元素。1.水是植物原生質(zhì)的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒，為生命活動不可缺少。配制培養(yǎng)基時一般用離子交換水、蒸餾水、重蒸餾水。（一）無機營養(yǎng)無機營養(yǎng)包括水和各種無機鹽，它們12382.無機鹽

無機鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫、氧、氮、磷、鉀、硫、鈣、氯、鎂。氮通常是指硝態(tài)氮或氨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝態(tài)氮形式來滿足培養(yǎng)物對氮素的需求，或?qū)煞N混合使用，有時也以硝態(tài)氮為主，補加（NH4）2SO4以滿足酸性植物的需要。磷是植物的必須元素之一，參與植物生命活動中核酸、蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用、及能量的貯存、轉(zhuǎn)化與釋放等重要生理生化過程，因此在組織培養(yǎng)物中需大量的磷。鉀是主要的陽離子，近年來在培養(yǎng)基中的用量呈逐漸提高的趨勢。鈣、鈉、鎂的用量較少。微量元素是指鐵、硼、錳、鋅、鈷、鉬、銅等，其需要量很少，一般多為10-5~10-7mol.L-1，稍多則產(chǎn)生毒害。

2.無機鹽無機鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫2391.碳源(能源)

植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作用的能力較低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物作為生長發(fā)育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖為最常用，效果也最好。然而在體細胞組織培養(yǎng)中，葡萄糖、麥芽糖和山梨醇也有影響；在花藥培養(yǎng)中，麥芽糖也有促進作用。糖類在培養(yǎng)基中除了作為碳源和能源以外，還具有維持培養(yǎng)基一定的滲透壓的作用。大多數(shù)植物細胞對蔗糖的需求范圍是1%~5%，但個別植物組織培養(yǎng)中蔗糖的濃度也可高達7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花藥培養(yǎng)。一般來說，蔗糖作為碳源和滲透劑的比例約為3：1~3：2，即約有1/4~2/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓。

（二）有機成分1.碳源(能源)植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作240