目的基因的分離課件

第六節(jié)目的基因的獲得（基因克?。?/p>

第六節(jié)目的基因的獲得（基因克?。?/p>

1一、目的基因定義：基因工程的主要目的是通過(guò)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的重組，獲得具有高度應(yīng)用價(jià)值的新物質(zhì)（品系），為此必須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離出可用于克隆的相關(guān)基因，這樣的基因通常稱之為目的基因，目的基因主要是結(jié)構(gòu)基因。目的基因可以是完整的基因（包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子），也可以是基因的部分片斷。一、目的基因定義：基因工程的主要目的是通過(guò)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的2二、結(jié)構(gòu)基因的組成作為一個(gè)能轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)構(gòu)基因必須包括轉(zhuǎn)

錄啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子：是DNA上RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和

促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列。基因編碼區(qū)：包括起譯碼ATG、開(kāi)放閱讀框和

休止碼TAA(TAG、TGA).終止子：是一個(gè)能提供轉(zhuǎn)錄停止信息的核苷酸

序列。二、結(jié)構(gòu)基因的組成作為一個(gè)能轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)構(gòu)基因必須包括轉(zhuǎn)3原核生物結(jié)構(gòu)基因的組成編碼區(qū)：原核生物的基因多數(shù)以操作子形式存在，完成同類功能的多個(gè)基因聚集在一起，處于同一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，下游同具一個(gè)終止子。原核生物基因在起譯碼ATG上游約10bp處，有一個(gè)富含嘌呤核苷酸的SD保守序列區(qū)，一般為AGGA,由此區(qū)轉(zhuǎn)錄的序列是翻譯時(shí)核糖體識(shí)別、結(jié)合mRNA的位置，核糖體由此位置向前移動(dòng)，尋找起譯碼AUG.啟動(dòng)子：原核生物的啟動(dòng)子含－35序列保守區(qū)5‘TTGACA3’提供RNA聚合酶識(shí)別的信號(hào)；－10序列保守區(qū)5‘TATAAT3’，DNA雙鏈從此解開(kāi)雙鏈轉(zhuǎn)錄。操縱子除了啟動(dòng)子以外，還有一些調(diào)控轉(zhuǎn)錄的其他因子，如調(diào)節(jié)因子和操縱因子等.終止子：原核生物基因轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文序列結(jié)構(gòu)，使RNA聚合酶減緩移動(dòng)或停止RNA的合成。原核生物結(jié)構(gòu)基因的組成編碼區(qū)：原核生物的基因多數(shù)以操作子形式4真核生物結(jié)構(gòu)基因的組成基因編碼區(qū)：真核生物染色體基因組的基因是單獨(dú)存在的，并且兩個(gè)基因之間有很長(zhǎng)的間隔序列區(qū)（內(nèi)含子）；啟動(dòng)子：真核生物結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子通常包含3個(gè)保守序列區(qū)：在－20至－30序列區(qū)有一個(gè)TATA框，DNA雙鏈在此處開(kāi)始解開(kāi)；在－75序列區(qū)有一個(gè)CAAT框，其作用是與RNA聚合酶結(jié)合有關(guān)；在更上游處有一個(gè)GC框，是某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列；終止子：高等真核生物結(jié)構(gòu)基因休止碼序列下游有一保守的AATAAA序列提供轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的釋放信號(hào)；真核生物染色圖基因組的結(jié)構(gòu)基因不具有SD序列區(qū)，核糖體與轉(zhuǎn)錄的mRNA的結(jié)合靠mRNA5’端添加的“帽”結(jié)構(gòu)；真核生物結(jié)構(gòu)基因的組成基因編碼區(qū)：真核生物染色體基因組的基因5其他類型基因組的基因組成質(zhì)?；蚪M病毒（噬菌體）基因組線粒體基因葉綠體基因組其他類型基因組的基因組成質(zhì)?；蚪M6三、目的基因的分離方法三、目的基因的分離方法71.PCR技術(shù)獲取目的基因1.PCR技術(shù)獲取目的基因8反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR，即RT－PCR（ReverseTranscriptionPCR），是將逆轉(zhuǎn)錄與PCR相結(jié)合的技術(shù)。可分為兩步：逆轉(zhuǎn)錄：引物可以是Oligo(dT)12-18或基因特異引物，模板是總RNA或mRNA；PCR：以mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈為模板，引物用基因特異引物或從蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物群以及Oligo(dT)12-18等。反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR，即RT－PCR（ReverseT9已知目的基因序列的RT-PCR根據(jù)目的基因的編碼區(qū)序列兩側(cè)設(shè)計(jì)正反引物，一個(gè)是逆轉(zhuǎn)錄引物作為反義引物，另一個(gè)是基因特異正向引物，兩個(gè)引物必須保證能擴(kuò)增出基因的編碼區(qū)序列。已知目的基因序列的RT-PCR根據(jù)目的基因的編碼區(qū)序列兩側(cè)設(shè)10已知目的基因蛋白產(chǎn)物的N端部分氨基酸序列信息時(shí)，就可以以此設(shè)計(jì)特異引物，RNA從中通過(guò)RT-PCR獲得目的基因。首先Oligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄第一鏈，接著以N端部分氨基酸序列反推的簡(jiǎn)并引物為正向引物，Oligo(dT)12-18為反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。從基因編碼部分氨基酸序列出發(fā)的RT-PCR已知目的基因蛋白產(chǎn)物的N端部分氨基酸序列信息時(shí)，就可以以此設(shè)11依據(jù)部分序列信息獲得基因全長(zhǎng)序列如果獲得的目的基因的DNA片斷是不完整的，那么基因有必要根據(jù)已知的序列獲得目的基因全長(zhǎng)的序列。目的基因完整序列的獲得對(duì)基因結(jié)構(gòu)分析、蛋白表達(dá)及基因功能的研究至關(guān)重要。依據(jù)部分序列信息獲得基因全長(zhǎng)序列如果獲得的目的基因的DNA片12反向PCR反向PCR是一種根據(jù)已知DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以包含已知區(qū)和未知區(qū)的環(huán)化DNA分子為模板來(lái)擴(kuò)增未知DNA區(qū)序列的PCR技術(shù)；首先提取基因組DNA，用一種在已知DNA區(qū)沒(méi)有識(shí)別位點(diǎn)的限制酶切割，產(chǎn)生含上、下游未知區(qū)域DNA片斷，然后通過(guò)T4DNA連接酶處理形成首尾相連的雙鏈環(huán)狀DNA。根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)兩套巢式引物即外測(cè)引物S1、A1和內(nèi)側(cè)引物S2、A2進(jìn)行巢式PCR，獲得特異PCR產(chǎn)物。測(cè)序后獲得已知序列。較小的環(huán)化DNA分子，擴(kuò)增效率高。反向PCR反向PCR是一種根據(jù)已知DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以13盒式PCR盒式PCR是利用cassette（人工合成的帶有適當(dāng)限制性酶的黏性末端較長(zhǎng)的雙鏈DNA分子）盒cassette上的引物，特異性擴(kuò)增目的基因組DNA未知區(qū)域的一種有效的方法。首先用適當(dāng)?shù)脑谝阎狣NA區(qū)沒(méi)有識(shí)別位點(diǎn)的限制酶切，產(chǎn)生含上、下游未知區(qū)域DNA分子然后與含有對(duì)應(yīng)限制酶切位點(diǎn)的cassette進(jìn)行連接。接著用cassette引物1（C1）盒根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)的特異反向引物1(ASP1)配對(duì)，cassette引物2（C2）和根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)的特異反向引物2(antisenseprimer2,ASP2)配對(duì),進(jìn)行巢式PCR來(lái)擴(kuò)增基因的上游未知區(qū)。同樣用根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)的特異正向引物1(senseprimer1,SP1)和引物C1配對(duì),特異正義引物2(senseprimer2,SP2)和C2配對(duì),通過(guò)巢式PCR來(lái)擴(kuò)增基因的下游未知區(qū)。（圖）盒式PCR盒式PCR是利用cassette（人工合成的帶有適14第六節(jié)目的基因的分離課件15RACE技術(shù)RACE是一種通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù),是以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA第一條鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到3‘或5’之間的未知序列的方法,分別稱3‘-RACE或5’-RACE；錨定PCR(anchoredPCR,即序列未知的單鏈模板3‘一末端添加同聚物尾巴從而獲得與尾巴互補(bǔ)的引物結(jié)合位置的PCR方法)和反向PCR都可以用于RACE技。經(jīng)典RACE就是基于錨定PCR技術(shù)原理設(shè)計(jì)的，而高特異性的RACE則借助于反向PCRRACE技術(shù)RACE是一種通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克16第六節(jié)目的基因的分離課件172.篩選基因文庫(kù)獲取目的基因2.篩選基因文庫(kù)獲取目的基因18基因文庫(kù)的概念所謂基因文庫(kù),通俗地講就是通過(guò)克隆的方法將某一基因組所有DNA或mRNA，利用適當(dāng)?shù)妮d體保存于適當(dāng)宿主菌或噬菌體中形成的轉(zhuǎn)化子群,所有重組DNA序列總和代表基因組的DNA全序列；基因文庫(kù)包括基因組文庫(kù)(genomiclibrary)和cDNA文庫(kù)(cDNAbank)；構(gòu)建基因文庫(kù)的目的不僅僅是將生物的遺傳信息以穩(wěn)定的克隆形式存儲(chǔ)起來(lái)，更為重要的是還能成為分離目地基因的主要途徑和基礎(chǔ)；基因文庫(kù)的容量：物種的基因組越大，目的基因在基因組中的拷貝數(shù)越少；克隆載體容量越小，所需克隆的數(shù)目就越多；目的基因在基因組中的拷貝數(shù)越多，越容易篩選到該基因。基因文庫(kù)的概念19基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因組文庫(kù)的構(gòu)建實(shí)際就是基因組片段的克隆過(guò)程?；蛭膸?kù)的構(gòu)建過(guò)程如下：①生物基因組DNA的提取和片段化（制備成適合克隆長(zhǎng)度和相應(yīng)末端的片斷DNA）；②載體選擇和制備；③DNA片段和載體的連接；④重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞（大腸埃細(xì)菌或酵母等）DNA；⑤初庫(kù)的擴(kuò)增?；蚪M文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因組文庫(kù)的構(gòu)建實(shí)際就是基因組片段的克20第六節(jié)目的基因的分離課件21cDNA文庫(kù)的構(gòu)建高等真核生物的基因組一般都很大（104～107kb）從真核生物基因組文庫(kù)中篩選目的基的工作量十分繁重；真核物基因中往往含內(nèi)含子，即使分離出來(lái)，也不能在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)目的基因，因?yàn)樵巳狈φ婧松飉RNA轉(zhuǎn)錄后剪接系統(tǒng)不能完成的加工和拼接；cDNA文庫(kù)是從特定時(shí)空條件下表達(dá)的典型的真核生物細(xì)胞mRNA（典型的真核生物細(xì)胞有1000-30000個(gè)不同種類的mRNA序列），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA克隆構(gòu)建的。通過(guò)篩選以直接獲得編碼區(qū)序列。這些序列因?yàn)椴缓?‘端調(diào)控序列和內(nèi)含子，顯得“純凈”這是它的個(gè)優(yōu)點(diǎn)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建高等真核生物的基因組一般都很大（104～122總的提取RNA分離純化mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈的克隆cDNAcDNA克隆總的提取RNA23TwoLibraries：cDNALibraryvsGenomicLibrarymRNAcDNAReversetranscriptionChromosomalDNARestrictiondigestionGenesinexpressionTotalGeneCompletegeneGenefragmentsSmallerLibraryLargerLibraryVector:PlasmidorphageVector:PlasmidJuangRH(2019)BCbasicsTwoLibraries：cDNALibraryvs24篩選基因文庫(kù)獲取目的基因常用的篩選方法有核酸分子雜交法和免疫學(xué)篩選法。將構(gòu)建好保存起來(lái)的基因組文庫(kù)或文庫(kù)鋪平板形成含不同外源cDNA重組子轉(zhuǎn)化于菌落或噬菌斑；用菌落或噬菌斑原位雜交法可以篩選出含目的基因陽(yáng)性克??；如果構(gòu)建了表達(dá)型cDNA文庫(kù)，可以用免疫學(xué)方法來(lái)篩選目的基因。篩選基因文庫(kù)獲取目的基因常用的篩選方法有核酸分子雜交法和免疫25三.圖位克隆獲得目的基因

圖位克?。╩apbasedcloning）又稱定位克?。和ㄟ^(guò)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上,結(jié)合大容量載體構(gòu)建的基因組文庫(kù)(如YAC文庫(kù)、BAC文庫(kù))，用分子標(biāo)記的特異DNA片段為探針，可以通過(guò)染色體步移(chromosomewalking)或染色體登陸(chromosomelanding)獲得目的基因。三.圖位克隆獲得目的基因圖位克?。╩apbasedcl26第六節(jié)目的基因的分離課件27染色體步移染色體步移28染色體登陸染色體步移往往因?yàn)榈貌坏街丿B克隆而被打斷造成前功盡棄,或因?yàn)榛蚪M的復(fù)雜性高而遇到重復(fù)序列改變步移方向誤入歧途。構(gòu)建插入片段平均長(zhǎng)度大于目的基因與其緊密連鎖的分子標(biāo)記之間距離的基因組文庫(kù)，就可以通過(guò)篩庫(kù)直接獲得含目的基因的大克隆，接著從中分離出目的基因。這樣就完全避開(kāi)了步移的弊端，這種方法稱為染色體登陸。染色體登陸染色體步移往往因?yàn)榈貌坏街丿B克隆而被打斷造成前功29四.mRNA差別顯示技術(shù)獲得差異表達(dá)的基因

四.mRNA差別顯示技術(shù)獲得差異30絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly(A)尾，用Oligo(dT)12MN（共12種(4種M×3種N)）逆轉(zhuǎn)錄錨定引物，可以將所有的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成為大致相等但結(jié)構(gòu)不同的12份cDNA亞庫(kù),這個(gè)過(guò)程叫做差異顯示逆轉(zhuǎn)錄即DDRT。PCR所用的5’端引物為10mer的隨機(jī)引物,選擇不同種的5’端隨機(jī)引物可只擴(kuò)增總cDNA中的部分cDNA鏈。通常采用12種反轉(zhuǎn)錄錨定引物和20種5’端隨機(jī)引物進(jìn)行240組PCR擴(kuò)增,可以得到20000條左右的DNA條帶,每一條都代表一種特定的mRNA,基本重蓋了總mRNA的96%。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性的聚丙烯酷肢凝膠電泳可以顯示50～100條長(zhǎng)度在l00～500bp之間的條帶。如果將對(duì)照和誘導(dǎo)同時(shí)進(jìn)行DDRT-PCR,電泳結(jié)果在同一位置的條帶的有無(wú)可能顯示基因表達(dá)的”開(kāi)”與”關(guān)”即基因的特異表達(dá)。mRNA差別顯示技術(shù)原理絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly(A)尾，用Oligo(31第六節(jié)目的基因的分離課件32五.酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因

五.酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因33酵母雙雜交技術(shù)的基本原理酵母雙雜交體系基于許多真核生物轉(zhuǎn)錄激活蛋白因子(transcriptionalactivator)都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)且功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成：一個(gè)是與DNA調(diào)控序列結(jié)合的DNA結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain,DNA-BD)另外一個(gè)是與基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionalactivationdomain,AD)。二者單獨(dú)都不能激活及引發(fā)轉(zhuǎn)錄。如果通過(guò)DNA重組技術(shù)將兩個(gè)結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)分別克隆在不同的質(zhì)粒載體上：DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與已知的誘餌蛋白X組成融合蛋白,激活結(jié)構(gòu)域與另外未知的蛋白Y形成融合蛋白.這兩種載體共轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)。顯然,如果未知靶蛋白Y能與已知的誘餌蛋白X相互作用就會(huì)使GAU的DNA一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域空間上比較接近,2現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性,從而啟動(dòng)下游的報(bào)告基因的表達(dá)。常用的報(bào)告基因?yàn)長(zhǎng)acZ基因和His3基因。酵母雙雜交技術(shù)的基本原理酵母雙雜交體系基于許多真核生物轉(zhuǎn)錄34第六節(jié)目的基因的分離課件35六.T-DNA標(biāo)簽法獲得目的基因

六.T-DNA標(biāo)簽法獲得目的基因36七.生物信息技術(shù)分離和鑒定目的基因

七.生物信息技術(shù)分離和鑒定目的基因37利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)新基因基因表達(dá)序列標(biāo)簽（ExpressedSequenceTag,EST）是從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，所獲得的序列片段長(zhǎng)度一般約為60-500bp。這一方法也稱電子克隆(electroniccloning)EST(expressedsequencetags)是基因表達(dá)短的cDNA序列,包含基因編碼區(qū)的部分信息,因此稱為表達(dá)序列標(biāo)簽。隨著EST數(shù)據(jù)庫(kù)的快速增長(zhǎng),增加了發(fā)現(xiàn)新基因的可能性,特別是從實(shí)驗(yàn)獲得的與某一功能相聯(lián)系的新的EST出發(fā),發(fā)現(xiàn)新基因的幾率更大。利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)新基因的具體過(guò)程。利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)新基因基因表達(dá)序列標(biāo)簽（Express38通過(guò)蛋白家族的保守性分離目的基因功能相近的蛋白質(zhì)往往構(gòu)成一個(gè)蛋白家族或超級(jí)家族，在進(jìn)化上形成高度保守的氨基酸序列區(qū)域。因此可以以同源保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法獲得相關(guān)物種中這個(gè)蛋白家族的其他成員，也可以通過(guò)檢索和比對(duì)發(fā)現(xiàn)克隆的特定蛋白質(zhì)與某一蛋白質(zhì)家族達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為是該家族的成員，除非有別的證據(jù)否定這個(gè)推論。需要說(shuō)明的是，一個(gè)序列可能被指定為一個(gè)以上的蛋白家族,而蛋白的相似性只局限在某個(gè)區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。通過(guò)蛋白家族的保守性分離目的基因功能相近的蛋白質(zhì)往往構(gòu)成一39八.獲取目的基因方法的選擇策略

八.獲取目的基因方法的選擇策略40類型已知的信息獲得目的基因的方法1已知目的基因的部分序列或其他物種中同源基因的保守序列PCR相關(guān)的技術(shù)簡(jiǎn)便、快速地獲得全長(zhǎng)的目的基因已知的目的基因部分片段為探針從基因文庫(kù)中篩選。2已知基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物制備抗體通過(guò)免疫學(xué)方法篩選表達(dá)型cDNA文庫(kù)對(duì)蛋白N端測(cè)序后,以氨基酸序列反推核昔酸序列,或標(biāo)記為寡聚核昔酸探針篩選基因文庫(kù)或設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物通過(guò)PCR相關(guān)技術(shù)獲得目的基因3已有與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記或有可操作的功能性轉(zhuǎn)座子以基因組文庫(kù)為核心,轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法圖位克隆的方法4組織、細(xì)胞或誘導(dǎo)差異表達(dá)的基因DDRT-PCR獲得差異片段后RACE抑制雜交文庫(kù)篩選類型已知的信息獲得目的基因的方法1已知目的基因的部分序列或其41第六節(jié)目的基因的獲得（基因克?。?/p>

第六節(jié)目的基因的獲得（基因克隆）

42一、目的基因定義：基因工程的主要目的是通過(guò)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的重組，獲得具有高度應(yīng)用價(jià)值的新物質(zhì)（品系），為此必須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離出可用于克隆的相關(guān)基因，這樣的基因通常稱之為目的基因，目的基因主要是結(jié)構(gòu)基因。目的基因可以是完整的基因（包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子），也可以是基因的部分片斷。一、目的基因定義：基因工程的主要目的是通過(guò)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的43二、結(jié)構(gòu)基因的組成作為一個(gè)能轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)構(gòu)基因必須包括轉(zhuǎn)

錄啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子：是DNA上RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和

促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列。基因編碼區(qū)：包括起譯碼ATG、開(kāi)放閱讀框和

休止碼TAA(TAG、TGA).終止子：是一個(gè)能提供轉(zhuǎn)錄停止信息的核苷酸

序列。二、結(jié)構(gòu)基因的組成作為一個(gè)能轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)構(gòu)基因必須包括轉(zhuǎn)44原核生物結(jié)構(gòu)基因的組成編碼區(qū)：原核生物的基因多數(shù)以操作子形式存在，完成同類功能的多個(gè)基因聚集在一起，處于同一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，下游同具一個(gè)終止子。原核生物基因在起譯碼ATG上游約10bp處，有一個(gè)富含嘌呤核苷酸的SD保守序列區(qū)，一般為AGGA,由此區(qū)轉(zhuǎn)錄的序列是翻譯時(shí)核糖體識(shí)別、結(jié)合mRNA的位置，核糖體由此位置向前移動(dòng)，尋找起譯碼AUG.啟動(dòng)子：原核生物的啟動(dòng)子含－35序列保守區(qū)5‘TTGACA3’提供RNA聚合酶識(shí)別的信號(hào)；－10序列保守區(qū)5‘TATAAT3’，DNA雙鏈從此解開(kāi)雙鏈轉(zhuǎn)錄。操縱子除了啟動(dòng)子以外，還有一些調(diào)控轉(zhuǎn)錄的其他因子，如調(diào)節(jié)因子和操縱因子等.終止子：原核生物基因轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文序列結(jié)構(gòu)，使RNA聚合酶減緩移動(dòng)或停止RNA的合成。原核生物結(jié)構(gòu)基因的組成編碼區(qū)：原核生物的基因多數(shù)以操作子形式45真核生物結(jié)構(gòu)基因的組成基因編碼區(qū)：真核生物染色體基因組的基因是單獨(dú)存在的，并且兩個(gè)基因之間有很長(zhǎng)的間隔序列區(qū)（內(nèi)含子）；啟動(dòng)子：真核生物結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子通常包含3個(gè)保守序列區(qū)：在－20至－30序列區(qū)有一個(gè)TATA框，DNA雙鏈在此處開(kāi)始解開(kāi)；在－75序列區(qū)有一個(gè)CAAT框，其作用是與RNA聚合酶結(jié)合有關(guān)；在更上游處有一個(gè)GC框，是某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列；終止子：高等真核生物結(jié)構(gòu)基因休止碼序列下游有一保守的AATAAA序列提供轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的釋放信號(hào)；真核生物染色圖基因組的結(jié)構(gòu)基因不具有SD序列區(qū)，核糖體與轉(zhuǎn)錄的mRNA的結(jié)合靠mRNA5’端添加的“帽”結(jié)構(gòu)；真核生物結(jié)構(gòu)基因的組成基因編碼區(qū)：真核生物染色體基因組的基因46其他類型基因組的基因組成質(zhì)?；蚪M病毒（噬菌體）基因組線粒體基因葉綠體基因組其他類型基因組的基因組成質(zhì)?；蚪M47三、目的基因的分離方法三、目的基因的分離方法481.PCR技術(shù)獲取目的基因1.PCR技術(shù)獲取目的基因49反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR，即RT－PCR（ReverseTranscriptionPCR），是將逆轉(zhuǎn)錄與PCR相結(jié)合的技術(shù)。可分為兩步：逆轉(zhuǎn)錄：引物可以是Oligo(dT)12-18或基因特異引物，模板是總RNA或mRNA；PCR：以mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈為模板，引物用基因特異引物或從蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物群以及Oligo(dT)12-18等。反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR，即RT－PCR（ReverseT50已知目的基因序列的RT-PCR根據(jù)目的基因的編碼區(qū)序列兩側(cè)設(shè)計(jì)正反引物，一個(gè)是逆轉(zhuǎn)錄引物作為反義引物，另一個(gè)是基因特異正向引物，兩個(gè)引物必須保證能擴(kuò)增出基因的編碼區(qū)序列。已知目的基因序列的RT-PCR根據(jù)目的基因的編碼區(qū)序列兩側(cè)設(shè)51已知目的基因蛋白產(chǎn)物的N端部分氨基酸序列信息時(shí)，就可以以此設(shè)計(jì)特異引物，RNA從中通過(guò)RT-PCR獲得目的基因。首先Oligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄第一鏈，接著以N端部分氨基酸序列反推的簡(jiǎn)并引物為正向引物，Oligo(dT)12-18為反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。從基因編碼部分氨基酸序列出發(fā)的RT-PCR已知目的基因蛋白產(chǎn)物的N端部分氨基酸序列信息時(shí)，就可以以此設(shè)52依據(jù)部分序列信息獲得基因全長(zhǎng)序列如果獲得的目的基因的DNA片斷是不完整的，那么基因有必要根據(jù)已知的序列獲得目的基因全長(zhǎng)的序列。目的基因完整序列的獲得對(duì)基因結(jié)構(gòu)分析、蛋白表達(dá)及基因功能的研究至關(guān)重要。依據(jù)部分序列信息獲得基因全長(zhǎng)序列如果獲得的目的基因的DNA片53反向PCR反向PCR是一種根據(jù)已知DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以包含已知區(qū)和未知區(qū)的環(huán)化DNA分子為模板來(lái)擴(kuò)增未知DNA區(qū)序列的PCR技術(shù)；首先提取基因組DNA，用一種在已知DNA區(qū)沒(méi)有識(shí)別位點(diǎn)的限制酶切割，產(chǎn)生含上、下游未知區(qū)域DNA片斷，然后通過(guò)T4DNA連接酶處理形成首尾相連的雙鏈環(huán)狀DNA。根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)兩套巢式引物即外測(cè)引物S1、A1和內(nèi)側(cè)引物S2、A2進(jìn)行巢式PCR，獲得特異PCR產(chǎn)物。測(cè)序后獲得已知序列。較小的環(huán)化DNA分子，擴(kuò)增效率高。反向PCR反向PCR是一種根據(jù)已知DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以54盒式PCR盒式PCR是利用cassette（人工合成的帶有適當(dāng)限制性酶的黏性末端較長(zhǎng)的雙鏈DNA分子）盒cassette上的引物，特異性擴(kuò)增目的基因組DNA未知區(qū)域的一種有效的方法。首先用適當(dāng)?shù)脑谝阎狣NA區(qū)沒(méi)有識(shí)別位點(diǎn)的限制酶切，產(chǎn)生含上、下游未知區(qū)域DNA分子然后與含有對(duì)應(yīng)限制酶切位點(diǎn)的cassette進(jìn)行連接。接著用cassette引物1（C1）盒根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)的特異反向引物1(ASP1)配對(duì)，cassette引物2（C2）和根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)的特異反向引物2(antisenseprimer2,ASP2)配對(duì),進(jìn)行巢式PCR來(lái)擴(kuò)增基因的上游未知區(qū)。同樣用根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)的特異正向引物1(senseprimer1,SP1)和引物C1配對(duì),特異正義引物2(senseprimer2,SP2)和C2配對(duì),通過(guò)巢式PCR來(lái)擴(kuò)增基因的下游未知區(qū)。（圖）盒式PCR盒式PCR是利用cassette（人工合成的帶有適55第六節(jié)目的基因的分離課件56RACE技術(shù)RACE是一種通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù),是以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA第一條鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到3‘或5’之間的未知序列的方法,分別稱3‘-RACE或5’-RACE；錨定PCR(anchoredPCR,即序列未知的單鏈模板3‘一末端添加同聚物尾巴從而獲得與尾巴互補(bǔ)的引物結(jié)合位置的PCR方法)和反向PCR都可以用于RACE技。經(jīng)典RACE就是基于錨定PCR技術(shù)原理設(shè)計(jì)的，而高特異性的RACE則借助于反向PCRRACE技術(shù)RACE是一種通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克57第六節(jié)目的基因的分離課件582.篩選基因文庫(kù)獲取目的基因2.篩選基因文庫(kù)獲取目的基因59基因文庫(kù)的概念所謂基因文庫(kù),通俗地講就是通過(guò)克隆的方法將某一基因組所有DNA或mRNA，利用適當(dāng)?shù)妮d體保存于適當(dāng)宿主菌或噬菌體中形成的轉(zhuǎn)化子群,所有重組DNA序列總和代表基因組的DNA全序列；基因文庫(kù)包括基因組文庫(kù)(genomiclibrary)和cDNA文庫(kù)(cDNAbank)；構(gòu)建基因文庫(kù)的目的不僅僅是將生物的遺傳信息以穩(wěn)定的克隆形式存儲(chǔ)起來(lái)，更為重要的是還能成為分離目地基因的主要途徑和基礎(chǔ)；基因文庫(kù)的容量：物種的基因組越大，目的基因在基因組中的拷貝數(shù)越少；克隆載體容量越小，所需克隆的數(shù)目就越多；目的基因在基因組中的拷貝數(shù)越多，越容易篩選到該基因?；蛭膸?kù)的概念60基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因組文庫(kù)的構(gòu)建實(shí)際就是基因組片段的克隆過(guò)程。基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程如下：①生物基因組DNA的提取和片段化（制備成適合克隆長(zhǎng)度和相應(yīng)末端的片斷DNA）；②載體選擇和制備；③DNA片段和載體的連接；④重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞（大腸埃細(xì)菌或酵母等）DNA；⑤初庫(kù)的擴(kuò)增。基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因組文庫(kù)的構(gòu)建實(shí)際就是基因組片段的克61第六節(jié)目的基因的分離課件62cDNA文庫(kù)的構(gòu)建高等真核生物的基因組一般都很大（104～107kb）從真核生物基因組文庫(kù)中篩選目的基的工作量十分繁重；真核物基因中往往含內(nèi)含子，即使分離出來(lái)，也不能在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)目的基因，因?yàn)樵巳狈φ婧松飉RNA轉(zhuǎn)錄后剪接系統(tǒng)不能完成的加工和拼接；cDNA文庫(kù)是從特定時(shí)空條件下表達(dá)的典型的真核生物細(xì)胞mRNA（典型的真核生物細(xì)胞有1000-30000個(gè)不同種類的mRNA序列），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA克隆構(gòu)建的。通過(guò)篩選以直接獲得編碼區(qū)序列。這些序列因?yàn)椴缓?‘端調(diào)控序列和內(nèi)含子，顯得“純凈”這是它的個(gè)優(yōu)點(diǎn)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建高等真核生物的基因組一般都很大（104～163總的提取RNA分離純化mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈的克隆cDNAcDNA克隆總的提取RNA64TwoLibraries：cDNALibraryvsGenomicLibrarymRNAcDNAReversetranscriptionChromosomalDNARestrictiondigestionGenesinexpressionTotalGeneCompletegeneGenefragmentsSmallerLibraryLargerLibraryVector:PlasmidorphageVector:PlasmidJuangRH(2019)BCbasicsTwoLibraries：cDNALibraryvs65篩選基因文庫(kù)獲取目的基因常用的篩選方法有核酸分子雜交法和免疫學(xué)篩選法。將構(gòu)建好保存起來(lái)的基因組文庫(kù)或文庫(kù)鋪平板形成含不同外源cDNA重組子轉(zhuǎn)化于菌落或噬菌斑；用菌落或噬菌斑原位雜交法可以篩選出含目的基因陽(yáng)性克隆；如果構(gòu)建了表達(dá)型cDNA文庫(kù)，可以用免疫學(xué)方法來(lái)篩選目的基因。篩選基因文庫(kù)獲取目的基因常用的篩選方法有核酸分子雜交法和免疫66三.圖位克隆獲得目的基因

圖位克隆（mapbasedcloning）又稱定位克?。和ㄟ^(guò)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上,結(jié)合大容量載體構(gòu)建的基因組文庫(kù)(如YAC文庫(kù)、BAC文庫(kù))，用分子標(biāo)記的特異DNA片段為探針，可以通過(guò)染色體步移(chromosomewalking)或染色體登陸(chromosomelanding)獲得目的基因。三.圖位克隆獲得目的基因圖位克?。╩apbasedcl67第六節(jié)目的基因的分離課件68染色體步移染色體步移69染色體登陸染色體步移往往因?yàn)榈貌坏街丿B克隆而被打斷造成前功盡棄,或因?yàn)榛蚪M的復(fù)雜性高而遇到重復(fù)序列改變步移方向誤入歧途。構(gòu)建插入片段平均長(zhǎng)度大于目的基因與其緊密連鎖的分子標(biāo)記之間距離的基因組文庫(kù)，就可以通過(guò)篩庫(kù)直接獲得含目的基因的大克隆，接著從中分離出目的基因。這樣就完全避開(kāi)了步移的弊端，這種方法稱為染色體登陸。染色體登陸染色體步移往往因?yàn)榈貌坏街丿B克隆而被打斷造成前功70四.mRNA差別顯示技術(shù)獲得差異表達(dá)的基因

四.mRNA差別顯示技術(shù)獲得差異71絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly(A)尾，用Oligo(dT)12MN（共12種(4種M×3種N)）逆轉(zhuǎn)錄錨定引物，可以將所有的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成為大致相等但結(jié)構(gòu)不同的12份cDNA亞庫(kù),這個(gè)過(guò)程叫做差異顯示逆轉(zhuǎn)錄即DDRT。PCR所用的5’端引物為10mer的隨機(jī)引物,選擇不同種的5’端隨機(jī)引物可只擴(kuò)增總cDNA中的部分cDNA鏈。通常采用12種反轉(zhuǎn)錄錨定引物和20種5’端隨機(jī)引物進(jìn)行240組PCR擴(kuò)增,可以得到20000條左右的DNA條帶,每一條都代表一種特定的mRNA,基本重蓋了總mRNA的96%。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性的聚丙烯酷肢凝膠電泳可以顯示50～100條長(zhǎng)度在l00～500bp之間的條帶。如果將對(duì)照和誘導(dǎo)同時(shí)進(jìn)行DDRT-PCR,電泳結(jié)果在同一位置的條帶的有無(wú)可能顯示基因表達(dá)的”開(kāi)”與”關(guān)”即基因的特異表達(dá)。mRNA差別顯示技術(shù)原理絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly(A)尾，用Oligo(72第六節(jié)目的基因的分離課件73五.酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因

五.酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因74酵母雙雜交技術(shù)的基本原理酵母雙雜交體系基于許多真核生物轉(zhuǎn)錄激活蛋白因子(transcriptionalactivator)都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)且功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成：一個(gè)是與DNA調(diào)控序列結(jié)合的DNA結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain,DN