淺析HPLC梯度洗脫產(chǎn)生的“鬼峰”

10/10淺析HPLC梯度洗脫產(chǎn)生的“鬼峰”

空白進(jìn)樣洗脫（或零體積進(jìn)樣）時(shí)色譜基線上有時(shí)會(huì)產(chǎn)生離散峰，這可能會(huì)干擾分析物峰或增加色譜圖的分析難度，尤其是在進(jìn)行痕量分析時(shí)，但這樣情況可能很難理解或進(jìn)行排除故障，因?yàn)椴贿M(jìn)行任何樣品注入，“空白”色譜圖中也會(huì)得到離散的峰，我們稱之為“鬼峰”。首先我們需要了解HPLC的梯度洗脫機(jī)理。

反相HPLC梯度洗脫開(kāi)始時(shí)，洗脫液的電溶性弱-也就是說(shuō)，它只包含一小部分有機(jī)改性劑，而該有機(jī)改性劑是更強(qiáng)的溶劑。因此，洗脫液中甚至是弱疏水性的任何東西都可能被“截留”在分析柱頂部的固定相上（圖1）。

圖1：HPLC梯度洗脫開(kāi)始時(shí)在分析柱頂部捕獲疏水性分析物

此外，隨著洗脫液系統(tǒng)的洗脫強(qiáng)度在梯度過(guò)程中增加以及分析物帶開(kāi)始遷移通過(guò)固定相床，該帶的“前部”（最靠近檢測(cè)器）的洗脫強(qiáng)度將始終比在“檢測(cè)器”處的洗脫強(qiáng)度弱。帶的“后部”（最靠近進(jìn)樣器），因?yàn)楦鶕?jù)定義，較強(qiáng)的洗脫液會(huì)通過(guò)色譜柱入口進(jìn)入，從而將較弱的洗脫液從色譜柱中置換出來(lái)。這會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的“聚焦”過(guò)程，從而使分析物條帶的后部移動(dòng)快于前部條帶，從而壓縮了分析物條帶（圖2）。這是梯度分析中確定分析物峰寬的主要因素之一，為什么最終梯度分析中的所有峰都具有大致相同的峰寬。

圖2：梯度HPLC的峰壓縮

如果這些過(guò)程對(duì)我們的分析物起作用，那么不幸的是，它們也與流動(dòng)相污染物一起起作用，這些污染物可以被捕獲并隨后通過(guò)梯度分析聚焦，最終在梯度洗脫分析的“空白”色譜圖中最終顯示為離散峰。我們還可以推測(cè)，這也許是等度分析不易出現(xiàn)鬼峰的原因。

那么這些鬼峰是從哪里來(lái)的，我們可以采取什么措施來(lái)減輕它們的出現(xiàn)呢？不幸的是，它們可能來(lái)自我們通常在HPLC系統(tǒng)中可能使用的大多數(shù)試劑。文獻(xiàn)中列舉了幾種具有示例色譜圖的來(lái)源，以突出顯示潛在的污染源–以下是我個(gè)人觀察到的一些污染。

用于HPLC的水（色譜級(jí)）使用時(shí)通常是純凈水，但如果不正確清潔和維護(hù)，去離子/純化裝置中的水很可能含有細(xì)菌。細(xì)菌產(chǎn)生廢物并分解產(chǎn)生許多紫外線活性化合物，這些化合物會(huì)在梯度分析中產(chǎn)生鬼峰（圖3）。

圖3

確保所有水生產(chǎn)單元維護(hù)良好，并定期清潔用于盛放洗脫液的容器，密封墊清洗和針頭清洗的瓶子。避免使用基于表面活性劑的清潔劑（或根本不使用任何清潔劑！），因?yàn)槿绻徽_沖洗，這些清潔劑也會(huì)引起鬼峰（圖4）。

圖4：來(lái)自不同流動(dòng)相污染源的基線概況。

在用乙腈梯度洗脫之前，將60mL水性流動(dòng)相富集到HPLC色譜柱上后，獲得基線分布圖（254nm）的比較。上圖：水性流動(dòng)相，顯示來(lái)自富集的痕量污染物的峰（最大污染物峰高（HCmax）=1mAU）。底部：洗碗機(jī)洗滌劑（25μL/L，HCmax=39mAU）。為減少微生物的生長(zhǎng)，在需要流動(dòng)性的水相中至少使用15％的甲醇或5％的乙腈，并要將洗脫液保存在冰箱中，并要保存任何時(shí)間。

確保定期清潔放置在淋洗液儲(chǔ)槽中的沉降片/過(guò)濾器，因?yàn)檫@些沉降片/過(guò)濾器會(huì)藏有細(xì)菌（請(qǐng)勿對(duì)陶瓷/玻璃過(guò)濾器進(jìn)行超聲處理）。

如果問(wèn)題仍然存在，請(qǐng)考慮使用聚苯乙烯二乙烯基苯過(guò)濾器過(guò)濾水性洗脫液部分，同時(shí)也應(yīng)該評(píng)估從過(guò)濾器/過(guò)濾器外殼中浸出的可能性。

增塑劑–實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部有許多增塑劑來(lái)源，鄰苯二甲酸酯類增塑劑在實(shí)驗(yàn)室空氣和實(shí)驗(yàn)室表面無(wú)處不在。避免使用實(shí)驗(yàn)室的“薄膜”覆蓋洗脫液容器，尤其是那些包含揮發(fā)性溶劑或試劑（例如TFA）的膜，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)通過(guò)揮發(fā)性蒸氣的萃取而將增塑劑浸入洗脫液中。巴斯德塑料移液管，Tygon管，塑料稱量容器和尼龍手套也被證明是鄰苯二甲酸鹽和其他增塑劑材料的污染源。嘗試盡可能使用沖洗干凈的玻璃器皿，并避免在淋洗液生產(chǎn)過(guò)程中使用塑料設(shè)備，包括使用塑料溶劑瓶“補(bǔ)充”淋洗液至一定量，并且不要將淋洗液存儲(chǔ)在塑料容器中。滲濾液的另一潛在來(lái)源來(lái)自自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶蓋內(nèi)的隔墊，當(dāng)刺破時(shí)，該隔墊可將小碎片沉積到樣品液體中，實(shí)際上揮發(fā)性樣品可直接從完整的蓋中浸出增塑劑和其他成分?？梢允褂酶鞣N等級(jí)和類型的隔墊，包括專門(mén)設(shè)計(jì)用于最小化滲入樣品溶液中的滲濾液的隔墊。

圖5：HPLC制備水相流動(dòng)相時(shí)戴不同實(shí)驗(yàn)室手套類型的效果比較。

在用乙腈梯度洗脫之前，將60mL水性流動(dòng)相富集到HPLC色譜柱上后，獲得基線分布圖（254nm）的比較。（a）戴著預(yù)先清洗的較厚的可重復(fù)使用的丁腈手套而制備的水相流動(dòng)相，以及（b）使用薄的一次性丁腈手套而制備的水相，其流動(dòng)性和入口峰的增加導(dǎo)致污染物峰的水平和數(shù)量增加。

pH計(jì)探針–pH計(jì)探頭受到嚴(yán)重污染，沒(méi)有正確沖洗，在我們自己的實(shí)驗(yàn)室中也看到過(guò)這種情況。如果考慮到pH探頭表面的復(fù)雜性以及每天放置探頭的溶液數(shù)量，您就會(huì)開(kāi)始意識(shí)到為什么會(huì)發(fā)生這種交叉污染。除了確保正確沖洗pH探針外，較好做法是從洗脫液容器中取等分試樣以確定pH值，以免污染洗脫液體積。如今，當(dāng)試劑針對(duì)體積或重量“配方”進(jìn)行準(zhǔn)備時(shí)，這可能更實(shí)用。

有機(jī)溶劑–有關(guān)用于HPLC的有機(jī)溶劑質(zhì)量的文獻(xiàn)很多，但幾乎無(wú)一例外，規(guī)則是購(gòu)買(mǎi)質(zhì)量最好的溶劑并運(yùn)行一些測(cè)試梯度以評(píng)估所用梯度條件下溶劑在您的實(shí)驗(yàn)室中的真實(shí)純度。當(dāng)進(jìn)行痕量分析和/或使用較低的UV波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，溶劑質(zhì)量變得尤為重要，并且多種方法可以顯示出可能會(huì)被實(shí)驗(yàn)室級(jí)溶劑污染的跡象。當(dāng)然，大規(guī)模生產(chǎn)超純?nèi)軇┎皇且粋€(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程，并且不應(yīng)從對(duì)鬼峰起源的任何調(diào)查中減去溶劑。盡管已經(jīng)研究了許多用于進(jìn)一步純化溶劑的方法，但由于有機(jī)溶劑的強(qiáng)烈洗脫特性，使用吸附劑去除雜質(zhì)通常是不成功的?？梢酝ㄟ^(guò)注入越來(lái)越多的水來(lái)評(píng)估效果或通過(guò)逐漸增加的有機(jī)溶劑來(lái)平衡來(lái)評(píng)估溶劑污染的程度和來(lái)源（即，在梯度開(kāi)始時(shí)增加有機(jī)物的量（圖6））。

圖6：確定由水和乙腈中的雜質(zhì)引起的洗脫液重影峰的起源。

柱：ZorbaxXDB-C8，150mm×4.6mm，5μm，溫度40°C，2mL/min，λ=215nm。洗脫液A：水；洗脫液B：乙腈。時(shí)間表（分鐘，％B）：（0，{0,10or30}），（10，{0,10or30}），（20,100），（30,100），（無(wú)重新平衡時(shí)間）。試劑和添加劑-緩沖鹽的純度范圍很廣，有些不適合HPLC。潮解性鹽（例如醋酸銨）的純度可能會(huì)隨著時(shí)間的流逝而降低，塑料瓶/蓋中提供的鹽可能易受瀝濾液的影響。避免使用質(zhì)量較低的鹽和添加劑，并在可能的情況下，避免將其存儲(chǔ)在塑料瓶中或評(píng)估滲濾液的影響，并仔細(xì)控制存儲(chǔ)條件和保質(zhì)期。TFA有多種等級(jí)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)會(huì)氧化，通常變成淺棕色，這會(huì)增加洗脫液的UV吸收率，并且由于某些氧化產(chǎn)物還可能會(huì)導(dǎo)致重影峰。始終使用最純凈的流動(dòng)相添加劑，并運(yùn)行檢查梯度以評(píng)估洗脫劑導(dǎo)致的重影峰的可能性。

空氣峰–來(lái)自性能不佳的進(jìn)樣系統(tǒng)（由于針頭或進(jìn)樣閥周圍的泄漏引起的虹吸）產(chǎn)生的空氣也會(huì)在色譜圖中產(chǎn)生離散峰。加氣的洗脫液比未加氣的洗脫液具有更高的紫外線吸收率，因此，在高壓條件下進(jìn)樣時(shí)產(chǎn)生的加氣樣品的塞子可以模擬色譜圖中的“真實(shí)”峰。保持自動(dòng)進(jìn)樣器保養(yǎng)良好，如果在自動(dòng)進(jìn)樣器類型上可以使用零體積進(jìn)樣，請(qǐng)檢查這種現(xiàn)象。

系統(tǒng)污染–隨著有機(jī)物含量的變化，系統(tǒng)內(nèi)樣品污染物的積累會(huì)滲入洗脫液中，并且通過(guò)梯度聚焦可能會(huì)在整個(gè)色譜圖中顯示為離散峰（圖7）。重要的是要確保定期清潔和維護(hù)系統(tǒng)的易受影響區(qū)域，例如針座，轉(zhuǎn)子密封件和毛細(xì)管路的內(nèi)表面。

圖7：頂部–藥物雜質(zhì)方法（藍(lán)色色譜圖）和空白進(jìn)樣顯示出污染物峰的重要影響。

底部–清洗和沖洗自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣閥后進(jìn)行的相同分析。流動(dòng)相：A–20mM醋酸銨緩沖液B：乙腈。時(shí)間表（分鐘，％B）（0,5），（21,55），（24,95），（25,5）色譜柱流失–盡管色譜柱制造商做出了最大的努力，但有時(shí)固定的固定相或封端試劑可能會(huì)從表面浸出并最終進(jìn)入色譜柱，并受到與其他污染物相同的梯度聚焦機(jī)制（圖8）。盡管大多數(shù)色譜柱在適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件下都相當(dāng)穩(wěn)定，但苯基和氟化相往往會(huì)遭受更高的流失。請(qǐng)遵循制造商有關(guān)色譜柱使用和存儲(chǔ)的建議。

圖8靜置幾個(gè)小時(shí)后，使用全氟色譜柱（上圖）和C18色譜柱（下圖）首次進(jìn)樣序列。

隨后注入的全氟化柱顯示較少的流失。色譜柱：150mm×4.6mm，3μm，溫度40℃，1.5mL/min，λ=254nm。洗脫液A：水加0.1％甲酸;洗脫液B：甲醇加0.1％甲酸。