吸光光度法課件

第八章吸光光度法Spectrophotometry2022/11/23第八章吸光光度法Spectrophotometry202第一節(jié)概述一、吸光光度法基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。吸光光度法的分類（1）根據(jù)所用儀器的不同：目視比色法、光電比色法和分光光度法。（2）根據(jù)所吸收的波長范圍不同：紫外分光光度法(波長200～400nm),可見分光光度法(400～750nm)紅外光譜法(750～2500nm)2022/11/23第一節(jié)概述一、吸光光度法基于物質(zhì)對光的吸光光度法特點：（1）靈敏度高：10-5~10-6，10-7~10-8，10-10

mol·L-1（2）準確度高：比色分析，相對誤差5~10%，分光光度法，2~5%，1~2%；（3）應(yīng)用廣泛：可測定絕大多數(shù)無機物和許多有機物；（4）操作簡便儀器設(shè)備易普及。2022/11/23吸光光度法特點：（1）靈敏度高：10-5~10-6，10-7二、光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二像性。λν=c，E=hν=hc/λ單色光：復(fù)合光：由單一波長的光組成的光由不同波長的光組成的光Planck常數(shù)：h=6.626×10-34

J×S光的波長越短（頻率越高），其能量越大。白光(太陽光)：由各種單色光組成的復(fù)合光2022/11/23二、光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二像性。λν=c三、物質(zhì)對光的選擇性吸收1、吸收光譜的產(chǎn)生：吸收光譜原子吸收光譜：原子外層電子選擇性吸收某些波長電磁波線光譜分子吸收光譜：帶光譜由價電子躍遷產(chǎn)生的光譜，也稱紫外—可見光譜電子光譜振動—轉(zhuǎn)動光譜由分子振動或轉(zhuǎn)動能級躍遷引起的，也稱紅外光譜2022/11/23三、物質(zhì)對光的選擇性吸收1、吸收光譜的產(chǎn)生：吸收光譜原子吸收分子能量電子能振動能轉(zhuǎn)動能分子振動能級：分子內(nèi)部價電子運動，分子內(nèi)原子振動和分子繞其重心的轉(zhuǎn)動。2022/11/23分子能量電子能振動能轉(zhuǎn)動能分子振動能級：分子內(nèi)部價電子運動分子吸收光譜產(chǎn)生：分子吸收外界能量（光、電、熱）引起分子能級躍遷，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)2022/11/23分子吸收光譜產(chǎn)生：分子吸收外界能量（光、電、熱）引起分子能級電子躍遷能級較大，能量在1~20eV，紫外可見吸收光譜在200~780nm2022/11/23電子躍遷能級較大，能量在1~20eV，紫外可見吸收光譜在20物質(zhì)的顏色:

物質(zhì)的顏色由透過光決定。由于不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同具有不同量子化能級，產(chǎn)生的吸收不同。其顏色和光的吸收、透過、反射有關(guān)。2022/11/23物質(zhì)的顏色:物質(zhì)的顏色由透過光決定。由于不同的物①互補色光：把兩種適當顏色的光按一定的強度比例混合，成為白光，稱為互補色光。2022/11/23①互補色光：把兩種適當顏色的光按一定的強度比例混合，成為白光②無色：對光譜中各種色光透過程度相同。③有色：物質(zhì)的顏色由它透過或反射的光決定。④黑色:幾乎吸收所有的入射光。⑤白色:幾乎全部反射入射光。2022/11/23②無色：對光譜中各種色光透過程度相同。③有色：物質(zhì)的顏色由吸收曲線：測量某種物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度(即吸光度A)，以波長(λ)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得到的一條吸收光譜曲線。（1）吸收曲線用途：①進行定性分析；②進行定量分析；③選擇吸收波長；④判斷干擾情況。2022/11/23吸收曲線：測量某種物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度(即吸光度A第二節(jié)光的吸收定律一、朗伯-比爾定律描述物質(zhì)對單色光吸收強弱與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系入射光I0透射光ItT稱為透光率TransmittanceT取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%A：吸光度b：光程的長度(cm):比色皿的厚度c：溶質(zhì)的濃度K：比例常數(shù)，與物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長等有關(guān)，與濃度無關(guān)。2022/11/23第二節(jié)光的吸收定律一、朗伯-比爾定律描述物質(zhì)對單色光吸收c：mol/L摩爾吸光系數(shù)L·mol–1·cm-1MolarAbsorptivityc：g/L吸光系數(shù)AbsorptivityL·g–1·cm-1與a的關(guān)系：2022/11/23c：mol/L摩爾吸光系數(shù)L·mol–1·cm

的含義（１）是吸光物質(zhì)在一定波長和溶劑中的特征常數(shù)，反映該吸光物質(zhì)的靈敏度．值越大，表示該吸光物質(zhì)對此波長光的吸收能力越強，顯色反應(yīng)越靈敏，在最大吸收波長處的摩爾吸光系數(shù)常以

max表示；（２）根據(jù)朗伯－比耳定律，

＝A/bc由實驗結(jié)果計算，以總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，為表觀摩爾吸收系數(shù)，=Ma,M是摩爾質(zhì)量；2022/11/23的含義（１）是吸光物質(zhì)在一定波長和溶劑中的特征常數(shù)，

吸光度的加和性若溶液中含有兩種或兩種以上的吸光物質(zhì)，且各物間無相互作用，則測得的吸光度為各種吸光物質(zhì)吸光度之和。

如溶液中含有A、B兩物質(zhì)，對波長為λ的光均有吸收，則A=AA+AB2022/11/23吸光度的加和性若溶液中含有兩種或兩種以上的吸光

例題鐵（Ⅱ）濃度為5.0×10-4

g·L-1

的溶液，與1，10-鄰二氮菲反應(yīng)，生成橙紅色絡(luò)合物。該絡(luò)合物在波長508nm，比色皿厚度為2cm時，測得A=0.19。計算1，10-鄰二氮菲鐵的a及

。解：已知M(Fe)=55.852022/11/23例題鐵（Ⅱ）濃度為5.0×10-4g·L-1的溶液，與分光光度法定量分析常要繪制標準曲線，即固定液層的厚度及入射光的波長和強度，測定一系列不同濃度標準溶液的吸光度，以吸光度對標準溶液的濃度作圖（一過原點的直線），得到標準曲線。在相同條件下測定試樣的吸光度，從工作曲線查得試樣濃度，這就是工作曲線法。但在實際工作中，特別是濃度較大時，常會出現(xiàn)標準曲線不為直線的現(xiàn)象，這稱為偏離朗伯比爾定律。二.偏離朗伯-比爾定律的原因偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個方面：光學(xué)因素；化學(xué)因素2022/11/23分光光度法定量分析常要繪制標準曲線，即固定液層的厚度及入射光二.偏離朗伯-比爾定律的原因1、光學(xué)因素：非單色光引起的偏離嚴格地說，朗伯-比爾定律只適用于單色光。設(shè)入射光由1

和2

兩種波長組成，溶液的吸光質(zhì)點對兩種波長的光的吸收均遵從吸收定律對1：對2：2022/11/23二.偏離朗伯-比爾定律的原因1、光學(xué)因素：非單色光引起的偏離1+2

：若：或或2022/11/231+2：若：或或2022/10/11非單色光引起的對吸光定律的偏離對吸收光譜而言，b和c固定，

反映了隨波長變化的情況，單一波長，固定；不同波長，不同。因此，非單色光將導(dǎo)致對吸光定律的偏離。2022/11/23非單色光引起的對吸光定律的偏離對吸收光譜而言，b和c固2.化學(xué)因素：由溶液本身的化學(xué)和物理因素引起的偏離(1)由于介質(zhì)不均勻性引起的偏離當被測試液是膠體、乳濁液或懸浮物時，將對入射光產(chǎn)生散射現(xiàn)象，導(dǎo)致吸光度增大，而引起正偏離(偏向吸光度軸)。2022/11/232.化學(xué)因素：由溶液本身的化學(xué)和物理因素引起的偏離(1)由橙色(2)由于溶液中的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離如吸光物質(zhì)的離解、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等。Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO42-黃色2022/11/23橙色(2)由于溶液中的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離如吸光物質(zhì)的離解第三節(jié)目視比色法及光度計的基本部件一、目視比色法用眼睛比較溶液顏色深淺以測定物質(zhì)含量的方法。測定方法：標準系列法。標1標2標3標4標5未知2022/11/23第三節(jié)目視比色法及光度計的基本部件一、目視比色法用眼睛比較標準系列未知樣品2022/11/23標準系列未知樣品2022/10/113、優(yōu)點：設(shè)備簡單，操作方便，不要求嚴格遵守比爾定律。4、用途:用在要求不高的常規(guī)分析中。5、缺點：準確度不高，標準系列制作麻煩，容易受干擾。2022/11/233、優(yōu)點：設(shè)備簡單，操作方便，不要求嚴格遵守比爾定律。4、用二、分光光度法及光度計1、分光光度法：使用分光光度計進行測定的方法。2、與比色法比較：（1）是用儀器代替人眼進行測量，消除了人的主觀誤差，提高了準確度；（2）待測溶液中有其它有色物質(zhì)共存時，可以選擇適當?shù)膯紊夂蛥⒈热芤簛硐蓴_，因而提高選擇性；（3）在分析大批試樣時，使用標準曲線法可以簡化手續(xù)，加快分析速度。2022/11/23二、分光光度法及光度計1、分光光度法：使用分光光度計進行測定分光光度計Agilent6010紫外/可見分光光度計2022/11/23分光光度計Agilent6010紫外/可見分光光度計2022022/11/232022/10/113、光度計組成：2022/11/233、光度計組成：2022/10/113、光度計組成：光源—單色器—吸收池—檢測系統(tǒng)(1)光源：要求穩(wěn)定，強度高.常用6~12V鎢絲燈或鹵鎢燈，2600~2870K,發(fā)320nm~2500nm的連續(xù)光譜可見光部分用其360~800nm紫外光：氫燈，氘燈，185~350nm；2022/11/233、光度計組成：光源—單色器—吸收池—檢測系統(tǒng)(1)光源：要(2)單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，分為棱鏡和光柵兩種。光柵的分辨率比棱鏡大，可用的波長范圍也較寬。2022/11/23(2)單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，分為棱也稱吸收池，長方體，兩面透明，有玻璃和石英玻璃兩種，規(guī)格有0.5，1.0，2.0，5.0cm等；（3）吸收池：比色皿：玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)

2022/11/23也稱吸收池，長方體，兩面透明，有玻璃和石英玻璃兩種，規(guī)格有0（4）檢測器：檢測器的作用是接受從吸收池發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號進行測量。分為光電池、光電管、光電倍增管和光電二極管陣列。2022/11/23（4）檢測器：檢測器的作用是接受從吸收池發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成顯示裝置：檢流計，數(shù)顯，記錄儀，CRT。2022/11/23顯示裝置：檢流計，數(shù)顯，記錄儀，CRT。2022/10/11練習(xí)題1、人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長范圍是A.400~780nmB.200~320nmC.200~780nmD.200~1000nmA2、符合比爾定律的一有色溶液，當其濃度增大時，最大吸收波長和吸光度分別是A.不變，增加B.不變，減少C.增加，不變D.減少，不變A2022/11/23練習(xí)題1、人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長范圍是A.403、下列表述不正確的是A.吸收光譜曲線，表明了吸光度隨波長的變化關(guān)系B.吸收光譜曲線中,最大吸收處的波長為最大吸收波長C.吸收光譜曲線，以波長為縱坐標,以吸光度為橫坐標D.吸收光譜曲線，表明了吸光物質(zhì)的吸收特性C2022/11/233、下列表述不正確的是A.吸收光譜曲線，表明了吸光度隨波長4、影響有色物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)的因素是A.吸收池厚度B.入射光波長C.有色物質(zhì)溶液的濃度D.入射光的強度B2022/11/234、影響有色物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)的因素是A.吸收池厚度5、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當其濃度為c時，用1.00cm比色皿測得其透光度為T，，當濃度減小為0.50c時，，在同樣條件下測定，其透光率應(yīng)為A.T2B.2TC.T1/2D.T/2C2022/11/235、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當其濃度為c時，用1.06、在光度計的檢流計上刻有A和T，二者關(guān)系為7、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當其濃度為c時，吸光度A=0.30，那么當濃度為2c時，該溶液的吸光度A=0.602022/11/236、在光度計的檢流計上刻有A和T，二者關(guān)系為7、某有色物質(zhì)第四節(jié)顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇顯色反應(yīng)：將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)。顯色劑：與待測組分形成有色化合物的試劑。光度分析中，對于本身無吸收的待測組分，先要通過顯色反應(yīng)將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，然后測定吸光度或吸收曲線。在光度分析中選擇合適的顯色反應(yīng)，并嚴格控制反應(yīng)條件，是十分重要的。2022/11/23第四節(jié)顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇顯色反應(yīng)：將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橐?、顯色反應(yīng)的選擇1、顯色反應(yīng)的類型配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。2、對顯色反應(yīng)的要求：（1）選擇性好，干擾少，或干擾容易消除；（2）靈敏度足夠高:超高靈敏高靈敏中等不靈敏2022/11/23一、顯色反應(yīng)的選擇1、顯色反應(yīng)的類型配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。（3）有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。對于形成不同絡(luò)合比的絡(luò)合反應(yīng)，必須注意控制實驗條件，使形成一定組成的絡(luò)合物，以免引起誤差。（4）有色化合物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)足夠穩(wěn)定，至少保證在測量過程中溶液的吸光度變化小。這就要求有色化合物不受外界環(huán)境條件的影響：如日光照射、空氣中的氧核CO2；此外也不受溶液中其他化學(xué)因素的影響。2022/11/23（3）有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。對于形（5）有色化合物與顯色劑之間的顏色差別大。顯色劑在測定波長處無明顯吸收，試劑空白小。對比度：兩有色物質(zhì)最大吸收波長之差2022/11/23（5）有色化合物與顯色劑之間的顏色差別大。顯色劑在測定波長處二、顯色條件的選擇1、顯色劑的用量：待測組分顯色劑有色配合物2022/11/23二、顯色條件的選擇1、顯色劑的用量：待測組分顯色劑有色配合物2、溶液的酸度⑴影響顯色劑濃度和顏色；顯色劑不少是有機弱酸，因此酸度的變化，將影響顯色劑的平衡濃度，并影響顯色反應(yīng)的完全程度。⑵影響Mn+的存在狀態(tài);2022/11/232、溶液的酸度⑴影響顯色劑濃度和顏色；顯色劑不⑶影響配合物的組成2022/11/23⑶影響配合物的組成2022/10/113、顯色溫度的選擇一般在室溫，有時需加熱，通過實驗確定2022/11/233、顯色溫度的選擇一般在室溫，有時需加熱，通過實驗確定2024、顯色反應(yīng)時間制作吸光度-時間曲線5、溶劑：降低有色化合物離解度，增加靈敏度如在Fe(SCN)3的溶液中加入與水混溶的有機試劑（如丙酮），由于降低了Fe(SCN)3的解離度而使顏色加深，提高了測定靈敏度。2022/11/234、顯色反應(yīng)時間制作吸光度-時間曲線5、溶劑：降低有色化合物6、干擾及其消除：（1）控制溶液酸度（2）加入絡(luò)合掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑（3）利用氧化還原反應(yīng)改變離子的狀態(tài)（4）選擇適當?shù)牟ㄩL，要求吸收大，干擾?。?）選擇合適的參比溶液（6）采用適當?shù)念A(yù)先分離的方法2022/11/236、干擾及其消除：（1）控制溶液酸度（2）加入絡(luò)合掩蔽劑或氧三、顯色劑1、無機顯色劑應(yīng)用不多，因其生成絡(luò)合物不穩(wěn)定，靈敏度選擇性也不高。目前有使用價值的主要有：硫氰酸鹽：測定Fe3+、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb5+等。鉬酸銨：測定P、Si、W等。過氧化氫：測定V5+、Ti4+等2022/11/23三、顯色劑1、無機顯色劑應(yīng)用不多，因其生成絡(luò)合物不2、有機顯色劑：⑴特點：有機顯色劑大多能與金屬離子生成極其穩(wěn)定的螯合物，具有特征顏色，其選擇性，靈敏度均高。不少螯合物易溶于有機溶劑，可以進行萃取比色。有機顯色劑多是含有生色團和助色團的化合物2022/11/232、有機顯色劑：⑴特點：有機顯色劑大多能與金屬離⑵生色團：含有不飽和鍵的基團，如-N=N-,＞C=C＜,-N=O,＞C=O,＞C=S、醌基等。⑶助色團：某些含有孤對電子的基團如-OH,-RH,-NH2,-NHR,-SH,-Cl－,-Br－,-I－等。它們與生色團上的不飽和鍵相互作用,影響其吸收,使顏色加深（紅移）。2022/11/23⑵生色團：含有不飽和鍵的基團，如-N=N-,＞C=C＜,-N⑷類型：①偶氮類：偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等②三苯甲烷類：鉻天青S，二甲酚橙，結(jié)晶紫等③其它型：OO,NN,含S型等2022/11/23⑷類型：①偶氮類：偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等②三苯甲烷類：2022/11/232022/10/11第五節(jié)吸光度測量條件的選擇一、入射光波長的選擇1、原則：“吸收最大，干擾最小”，

大，A變化小的區(qū)域。選520nm進行測定2022/11/23第五節(jié)吸光度測量條件的選擇一、入射光波長的選擇1、原則：二、參比溶液的選擇1、蒸餾水：試液、顯色劑均無色時，用蒸餾水作參比；2、試劑空白：顯色劑有色時，用不加試樣溶液的試劑空白作參比；3、試液空白：試液中有其它有色離子時，用不加顯色劑的被測液作參比；2022/11/23二、參比溶液的選擇1、蒸餾水：試液、顯色劑均無色時，用蒸餾三、吸光度讀數(shù)范圍的選擇（1）（2）2022/11/23三、吸光度讀數(shù)范圍的選擇（1）（2）2022/10/11以有限值表示：一般光度計ΔT約為±0.2%~±2%。假定ΔT為0.5%，上式導(dǎo)數(shù)為零求出當T=0.368(A=0.434)時,Et最小(1.36%)。2022/11/23以有限值表示：一般光度計ΔT約為±0.2%~±2%。假定2022/11/232022/10/11A=0.15~1.0或T=70%~10%的范圍內(nèi)，濃度測量的相對誤差較小。2022/11/23A=0.15~1.0或T=70%~10%的范圍內(nèi)，濃度測量的四、標準曲線的制作1、制作依據(jù)吸光度與吸光物質(zhì)的含量呈正比關(guān)系2022/11/23四、標準曲線的制作1、制作依據(jù)吸光度與吸光物質(zhì)的含量呈正比關(guān)2、制作方法：在選擇的實驗條件下，從低濃度到高濃度分別測量一系列（不少于5）不同含量的標準溶液的吸光度，以標準溶液中待測組分的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得到一條通過原點的直線，稱為標準曲線（或工作曲線）。再測量待測溶液的吸光度，在標準曲線上就可以查到與之相對應(yīng)的被測物質(zhì)的含量。2022/11/232、制作方法：在選擇的實驗條件下，從低濃度到高濃度分別3、標準曲線不通過原點原因參比選擇不當；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清潔等。2022/11/233、標準曲線不通過原點原因參比選擇不當；吸收池厚度不等；吸收2022/11/232022/10/11練習(xí)題1、以M表示被測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量，則摩爾吸收系數(shù)

與吸光系數(shù)a之間的關(guān)系為B2022/11/23練習(xí)題1、以M表示被測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量，則摩爾吸收系數(shù)2、在光度分析中，選擇參比溶液