水質(zhì)檢驗(yàn)0課件

生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法－微生物指標(biāo)

GB/T5750.12-2006

陜西省疾病預(yù)防控制中心王安禮手公電話(huà)822291051

衛(wèi)生指標(biāo)菌概念及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則水樣的采集、保存與運(yùn)輸要領(lǐng)我國(guó)飲用水的微生物學(xué)檢驗(yàn)及衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T5750.12-2006樣品的檢驗(yàn)與報(bào)告2衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則指標(biāo)菌的概念:指標(biāo)菌（或稱(chēng)指示菌）(indicatorbacteria,orbacterialindicators）是指在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中，用以指示檢品衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物。3衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則

GB5749—2006規(guī)定的微生物檢驗(yàn)指標(biāo)共4項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)：菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌和2項(xiàng)非常規(guī)指標(biāo)：賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)。5

菌落總數(shù)（細(xì)菌總數(shù)）：水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37℃培養(yǎng)48h后，所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。水中菌落總數(shù)可作為評(píng)價(jià)水質(zhì)清潔程度和考核凈化效果的指標(biāo)。衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則6飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定菌落總數(shù)限值為每毫升水樣不超過(guò)100CFU。菌落總數(shù)增多說(shuō)明水樣已被污染，但不能說(shuō)明污染來(lái)源，也不能說(shuō)明該水體傳播傳染病的風(fēng)險(xiǎn)程度。因此，必須結(jié)合總大腸菌群來(lái)判斷水質(zhì)污染的來(lái)源和安全程度。衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則7總大腸菌群：指一群在37℃培養(yǎng)24h，能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。一般地說(shuō)，總大腸菌群能夠指示腸道傳染病存在的可能性，但它不是專(zhuān)一的指示菌。GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定100毫升水樣中不得檢出總大腸菌群。衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則8

耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）：

是指用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開(kāi)，在44.5℃仍能生長(zhǎng)的大腸菌群。主要來(lái)源于人和溫血?jiǎng)游锛S便，是水質(zhì)受糞便污染的重要指標(biāo)菌。檢出耐熱大腸菌群表明飲水已被糞便污染，有存在腸道致病菌和寄生蟲(chóng)等病原體的危險(xiǎn)。新國(guó)標(biāo)規(guī)定每100毫升水樣中不得檢出耐熱大腸菌群。衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則10大腸埃希氏菌是糞便污染最有意義的指示菌。新國(guó)標(biāo)規(guī)定：若檢出總大腸菌群，須進(jìn)行大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群檢測(cè)。若水樣中檢出大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群，說(shuō)明水體可能已受到糞便污染，存在發(fā)生腸道傳染病的可能性，必須采取相應(yīng)措施。衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則12水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)及限值指標(biāo)限值總大腸菌群/（MPN/100ml）或CFU/100ml）不得檢出耐熱大腸菌群/（MPN/100ml）或CFU/100ml）不得檢出大腸埃希氏菌/（MPN/100ml）或CFU/100ml）不得檢出菌落總數(shù)/（CFU/ml）100水質(zhì)非常規(guī)指標(biāo)指標(biāo)限值賈第鞭毛蟲(chóng)（個(gè)/10L）＜1隱孢子蟲(chóng)（個(gè)/10L）＜114

常規(guī)指標(biāo)是指能反映生活飲用水水質(zhì)基本狀況的水質(zhì)指標(biāo)，非常規(guī)指標(biāo)是指根據(jù)地區(qū)、時(shí)間或特殊情況需要實(shí)施的生活飲用水水質(zhì)指標(biāo)。衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則15新標(biāo)準(zhǔn)初步實(shí)現(xiàn)了與國(guó)際接軌。同時(shí)考慮到地區(qū)差異性，其中的“水質(zhì)非常規(guī)指標(biāo)及限值”的實(shí)施項(xiàng)目和日期由各省省級(jí)人民政府根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況確定，但是最遲于2012年7月1日必須實(shí)施。最新情況是：國(guó)家要求到2015年全國(guó)省會(huì)城市106項(xiàng)指標(biāo)實(shí)行全覆蓋；在地市級(jí)城市覆蓋42項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)。

衛(wèi)生指標(biāo)菌及衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)原則16水樣的采集、保存、運(yùn)輸要領(lǐng)

1、采集水樣應(yīng)該特別注意無(wú)菌操作，以防雜菌污染，盛水容器在采樣前必須洗刷干凈，進(jìn)行滅菌后備用（水樣瓶容量為500ml的磨口玻塞瓶，用紙包裹后滅菌）。

17水樣的采集、保存、運(yùn)輸要領(lǐng)

2、在取自來(lái)水水樣時(shí)，必須用清潔布將水龍頭擦干，再用95%酒精燒灼消毒水龍頭周?chē)?，然后把水龍頭完全打開(kāi)，放水5—10分鐘后再將水龍頭關(guān)小，采集水樣。經(jīng)常取水的水龍頭放水1—3分鐘后即可采集水樣。機(jī)井水的采樣與自來(lái)水相同。18水樣的采集、保存、運(yùn)輸要領(lǐng)

4、采集經(jīng)氯處理的水樣（如自來(lái)水、游泳池水）時(shí)，應(yīng)按每500ml水樣加入硫代硫酸鈉0.03g或其1.5%水溶液2ml，其目的是作為脫氯劑，以避免剩余氯對(duì)水樣中細(xì)菌的殺滅作用而影響檢測(cè)結(jié)果。20水樣的采集、保存、運(yùn)輸要領(lǐng)

5、水樣采集后，盡快于2小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。如路途較遠(yuǎn)，應(yīng)將水樣瓶置于6℃—10℃的冰壺內(nèi)運(yùn)送，運(yùn)送時(shí)間不得超過(guò)6小時(shí)，潔凈的水最多不超過(guò)12小時(shí)。21飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法

一、菌落總數(shù)—平皿計(jì)數(shù)法；二、總大腸菌群—多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法。三、耐熱大腸菌群—多管發(fā)酵法、濾膜法；四、大腸埃希氏菌—多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法。五、賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)—免疫磁分離熒光抗體法。23菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法：平板計(jì)數(shù)法1、以無(wú)菌操作方法用滅菌吸管吸取1ml充分混勻的水樣，注入滅菌平皿內(nèi)，傾注約15ml已融化并冷卻到45℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。每次檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)做一個(gè)平行樣，同時(shí)另用一個(gè)平皿只傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。2、待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，底面向上，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即為1ml水樣中的菌落總數(shù)。24菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法：平板計(jì)數(shù)法菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的2個(gè)平板和不同稀釋度的2個(gè)平板內(nèi)菌落的生長(zhǎng)情況。平行檢樣的2個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)應(yīng)該接近,不同稀釋度的幾個(gè)平板上的菌落數(shù)應(yīng)與檢樣倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大,菌落數(shù)越少，稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越多。26菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法：平板計(jì)數(shù)法如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反而比稀釋度小的平板上菌落數(shù)多，則可能是檢驗(yàn)工作中存在的差錯(cuò)，應(yīng)查明原因，予以糾正。27菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法：平板計(jì)數(shù)法若平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，而且菌落之間沒(méi)有明顯的界限，則一條鏈作為一個(gè)菌落；如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可計(jì)”報(bào)告結(jié)果，而應(yīng)在稀釋度最大的平板上，任意數(shù)其中2cm2內(nèi)的菌落數(shù)，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以皿底面積，即π×r2。28

總大腸菌群檢驗(yàn)步驟：最常用：多管發(fā)酵法（三步法）總大腸菌群檢驗(yàn)步驟：乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)平板分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)（MPN值報(bào)告結(jié)果）

30總大腸菌群檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）稀釋度的選擇：對(duì)檢樣特別是不了解其污染情況的樣品，則必須考慮其污染程度來(lái)選擇合適的稀釋度。對(duì)低污染樣品，選擇10、1、和0.1ml3個(gè)稀釋度，如果污染較嚴(yán)重，相應(yīng)稀釋度就應(yīng)大些，如1、0.1、0.01ml或更大。在無(wú)法估計(jì)其細(xì)菌污染量時(shí)，可多做幾個(gè)稀釋度，待結(jié)果出來(lái)后，可根據(jù)MPN表酌情選擇。31總大腸菌群檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）

1、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：取10ml水樣，接種到10ml雙倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1ml水樣，接種到10ml單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1ml水樣注入到9ml滅菌生理鹽水中，換一支吸管，混勻后吸取1ml（即0.1ml水樣）注入到10ml單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管。

32總大腸菌群檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）對(duì)已處理過(guò)的出廠自來(lái)水需經(jīng)常檢驗(yàn)或每天檢驗(yàn)一次的，可直接接種10ml水樣到10ml雙料培養(yǎng)基中，共接種5份。33總大腸菌檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）將接種管置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則可報(bào)告為總大腸菌群陰性，如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按以下步驟進(jìn)行。

34總大腸菌檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）2、分離培養(yǎng)：將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h--24h，觀察菌落形態(tài)，挑取符合下列特征的菌落作革蘭氏染色，鏡檢和證實(shí)試驗(yàn)。①深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；②紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；③淡紫色、中心較深的菌落。35總大腸菌檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）

3、證實(shí)試驗(yàn)：經(jīng)上述染色鏡檢為Gˉ無(wú)芽孢桿菌，同時(shí)接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，置36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實(shí)有總大腸菌群存在。4、結(jié)果報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為總大腸菌群陽(yáng)性管數(shù)，查MPN值表。報(bào)告每100ml水樣中的總大腸菌群最可能數(shù)。稀釋樣品查表后所得結(jié)果應(yīng)乘稀釋倍數(shù)。36總大腸菌檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）注意事項(xiàng)：挑選菌落與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，在實(shí)際工作中，往往為了節(jié)省人力和時(shí)間，通常只挑取一個(gè)菌落，由于概率的問(wèn)題，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑選菌落時(shí)一定要挑取典型菌落，如無(wú)典型菌落時(shí)應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。37總大腸菌檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）除典型的大腸菌群菌落外，特別注意對(duì)非典型大腸菌群菌落的鑒別，這些菌落往往無(wú)金屬光澤、色淡、也要進(jìn)行革蘭染色鏡檢，并接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)基。證實(shí)為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌并能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則仍判定為大腸菌群陽(yáng)性。38耐熱大腸菌群檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）

自總大腸菌群乳糖發(fā)酵試驗(yàn)中的陽(yáng)性管（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）中取1滴轉(zhuǎn)種于EC培養(yǎng)基中，置44.5℃±0.5℃水浴箱或隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（水浴箱的水面應(yīng)高于試管中培養(yǎng)基液面），培養(yǎng)24h±2h，如所有管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性，如有產(chǎn)氣者，則轉(zhuǎn)種于伊紅美蘭瓊脂平板上，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)18h--24h，凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為耐熱大腸菌群陽(yáng)性。39大腸埃希氏菌檢驗(yàn)步驟：

（多管發(fā)酵法）

將總大腸菌群多管發(fā)酵初發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的陽(yáng)性管進(jìn)行大腸埃希氏菌檢測(cè)。1，接種：用燒灼滅菌的金屬接種環(huán)或滅菌棉簽將上述試管中液體接種到EC-MUG管中。2，培養(yǎng)：將已接種的EC-MUG管在培養(yǎng)箱或恒溫水浴箱中44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。如使用恒溫水浴，在接種后30min內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，使水浴箱的液面超過(guò)EC-MUG管的液面。403、結(jié)果觀察與報(bào)告：將培養(yǎng)后的EC-MUG管在暗處用波長(zhǎng)為366nm功率為6W的紫外光燈照射，如果有蘭色熒光產(chǎn)生則表示水樣中含有大腸埃希氏菌。計(jì)算EC-MUG陽(yáng)性管數(shù)，查對(duì)應(yīng)的最可能數(shù)（MPN）表得出大腸埃希氏菌的最可能數(shù)，結(jié)果以MPN/100ml報(bào)告。大腸埃希氏菌檢驗(yàn)步驟：（多管發(fā)酵法）41樣品的檢驗(yàn)與報(bào)告樣品的送檢與保存。為了避免樣品變質(zhì)和樣品中微生物的增殖或死亡，原則上送檢時(shí)間越短越好，不能及時(shí)送檢的樣品，一般要求在低溫條件下保存（特別是有些食品樣品要冷藏或冷凍）。42樣品的檢驗(yàn)與報(bào)告如果一個(gè)樣品需做多種分析，如微生物、化學(xué)、毒理等，宜先取出部分樣品做微生物檢驗(yàn)，其余部分留做其它檢驗(yàn)用。43樣品的檢驗(yàn)與報(bào)告稀釋度的選擇：對(duì)檢樣特別是不了解其污染情況的樣品，則必須考慮其污染度來(lái)選擇稀釋度。對(duì)低污染樣品，選擇10、1、和0.1ml3個(gè)稀釋度，如果污染較嚴(yán)重，相應(yīng)稀釋度就應(yīng)大些，如1、0.1、0.01ml或更大。在無(wú)法估計(jì)其細(xì)菌污染量時(shí)，可多做幾個(gè)稀釋度，待結(jié)果出來(lái)后，可根據(jù)MPN表酌情選擇。44樣品的檢驗(yàn)與報(bào)告分離培養(yǎng)時(shí)接種陽(yáng)性試管的選擇：假如接種5個(gè)10ml樣品，所有產(chǎn)氣產(chǎn)酸的管都做分離培養(yǎng)；假如接種15支管，那就要選擇所有各管都陽(yáng)性的最小樣品量，例如經(jīng)培養(yǎng)后，1ml、0.1ml各5管、0.01ml4管，均呈陽(yáng)性結(jié)果，選擇MPN編碼為5—5—4，進(jìn)行分離培養(yǎng)即1ml、0.1ml、0.01ml的陽(yáng)性管。45樣品的檢驗(yàn)與報(bào)告MPN檢索表：MPN是表示樣品活菌密度的估測(cè)數(shù)。為了獲得該菌數(shù)的估計(jì)數(shù)量，檢品接種多個(gè)管或經(jīng)過(guò)幾次稀釋接種多個(gè)管，該表為1